Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Учебно-методические материалы

Основная литература

1. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии.- М.: Мир, 1989.- 692 с.

2. Березин И. В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа.- М.: Высш. школа, 1977. - 280 с.

3. Березин И. В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.- М.:МГУ, 1976. - 320 с.

4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс.- М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.- 720 с.

5. Введение в прикладную энзимологию: Учеб. пособие/ Под ред. И. В. Березина и К. Мартинека, М.:МГУ, 1982.

6. Р.Досон, Д.Эллиот, У.Эллиот, К.Джонс. Справочник биохимика.- М.: Мир.-1991 год.

7. Егоров А.М., Осипов Л.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.:Высшая школа.-1991 г.

8. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. шк., 1980, 324 с.

9. Практикум по биохимии./ Под рад. С.Е.Северина и Г.А.Соловьевой. – М.:Издательство МГУ.-1983 г.

10. Практическая энзимология / Х. Биссвангер; пер. с англ.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010.- 328 с.

 

Дополнительная литература

1. Практическая химия белка. Пер. с англ./ П./ред. А.Дарбре. – М.: Мир, 1989 г.

2. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.3. Справочник биохимика: Пер. с анг./ Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. – М.: Мир, 1991. – 544 с.

4. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир, 1980.- 432 с.

 

Интернет-ресурсы:

1. Курс лекций по энзимологии: http://www.distedu.ru/edu2/

2. Курс лекций по кинетике и термодинамике ферментативных реакций: http://www.distedu.ru/edu3/

 

По учебному плану лаб. работы 24 часа. Наш план - лекции и лаб. работы.

  1. Лекция 1.
  2. Семинар с вашим планом эксперимента по определению кинетических параметров.
  3. Работа.
  4. Самостоят работа – планирование собственного эксперимента на основе различных практикумов с ферментами, в частности Практической энзимологии. Это может быть: выделение фермента, влияние условий на кинетику (различные субстраты, температура, рН, состав буфера). Модификация и ее влияние на кинетику (IgG, альбумин. Модификация совиалем, ПЭГ, ПВП, гепарин, мелкая органика, гентамицин и т.д). Анализ 1 работы по модификации белка (5 курс, О.Ю.). Иммобилизация в геле, на сефарозе.
  5. Самостоятельно разработанный эксперимент

Лекция 1. Теория ферментативного анализа (2 часа)

1. Теория ферментативной реакции.

2. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

3. Анализ кинетической кривой.

4. Проведение ферментативного анализа.

5. Активность фермента.

 

  1. Чудесные ферменты
    1. Эффективность
    2. Сопряжение процессов
    3. Регуляция

На сегодняшний день описано свыше 3 тыс. различных ферментов. По оценкам, в природе их существует около 25 тыс. В продажу поступает не более 300. Ферменты – чрезвычайно эффективные катализаторы. Они ускоряют реакции в 108-1010 раз, а иногда и в 1012 раз (Menger, 1993). Но есть и удивительные примеры: оротидин-5’-фосфат-декарбоксилаза ускоряет реакцию в 1017 раз. То есть без участия фермента период полуреакции составляет 78 млн лет (Radzicka & Wolfenden, 1995)!

Преимущество ферментов не только в том, что они быстрее достигают равновесия, но также и в том, что они могут сопрягать процессы, которые без участия ферментов вообще не могли бы осуществиться ни за какое время! Примером могут служить ферменты дыхательной цепи - ∆μН-генераторы, сопрягающие перенос электронов (окислительно-восстановительные реакции) с переносом протонов через мембрану, а также другие транспортеры.

Наиболее важной функцией ферментов можно считать регуляцию метаболизма клетки, без которой невозможно представить существование самой жизни. Регуляция может осуществляться двумя путями: регуляция количества фермента (на уровне регуляции гена, его транскрипции, трансляции, скорости деградации фермента) либо регуляция активности молекулы фермента. Белковая природа фермента идеально подходит для выполнения функций. Во-первых, функциональные группы аминокислотных остатков белка способны формировать активные центры и специфические участки связывания. Во-вторых, белки обладают достаточной гибкостью для того, чтобы способствовать образованию и стабилизации переходных состояний и индуцировать конформационные изменения, необходимые для ускорения реакции. Двадцати основных аминокислот с разнообразными радикалами вполне достаточно для образования специфических участков. Однако, иногда, особенно для выполнения катализа, необходимо участие веществ небелковой природы, таких как коферменты (специфические факторы, способные диссоциировать из комплекса с белком) и простетические группы (не способны диссоциировать). Примеры коферментов: NAD(P), тиаминдифосфат, кофермент А. Простетические группы – FAD, гемы, порфирины, пиридоксамин, липоевая кислота, биотин, тетрагидрофолиевая кислота. Многим ферментам для выполнения своей функции и для сохранения структуры необходимы ионы металлов. Ионы Mg2+способствуют связыванию фосфатных групп ADP, ATP и тиаминдифосфата с ферментами. Ионы железа (в цитохромах), кобальта (в корриновой системе колец), меди (в цитохромоксидазе, тирозиназе и др), цинка (в карбоангидразе и алкогольдегидрогеназе), молибдена (в нитрогеназе), марганца (в аргиназе и ксилозоизомеразе) и селена (в глутатионпероксидазе) необходимы для катализа.

Белковая природа ферментов помогает им адаптироваться к взаимодействию с любым необходимым лигандом в результате мутаций. Это свойство широко применяется в биотехнологии. Методы направленного мутагенеза позволяют изменять специфичность и функции ферментов. Молекулярное моделирование (белковый дизайн) позволяет прежде смоделировать определенные модификации, а затем реализовать их путем введения соответствующих мутаций. Примером может служить гидроксиизокапроатдегидрогеназа, катализирующая восстановительное превращение α-кетокислоты в хиральную молекулу гидроксикарбоновой кислоты (гидроксианалог аминокислоты). Лучшим субстратом для данного фермента является α-кетокапроновая кислота. Аналог субстрата – α-изокетокапроновая кислота – подвергается превращению с гораздо меньшей эффективностью. Методом направленного мутагенеза каталитическая эффективность фермента по отношению к данному субстрату (kcat/KM) была повышена на 4 порядка, а по отношению к фенилглиоксилату – на 2 порядка по сравнению с физиологическим субстратом (Feil, 1994).

С другой стороны, белковая природа ферментов делает их чрезвычайно чувствительными к влиянию окружающей среды – температуры, рН, ионной силы, составу растворителя. Поэтому максимальная активность реализуется лишь в строго определенных условиях. Следует отметить, что некоторые виды РНК также обладают каталитической активностью.

 

2. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

В 1913 г. Михаэлис и Ментен, развив идеи других исследователей, предложили следующую схему:

(1)

Каталитическая реакция состоит из двух стадий. Сначала фермент и субстрат соединяются и образуют фермент-субстратный комплекс ES. Предполагается, что эта стадия протекает быстро, обратимо и не сопровождается какими-либо химическими изменениями. Фермент и субстрат удерживаются вместе за счет сил физической природы. На второй стадии протекают химические процессы, характеризующиеся константой скорости первого порядка kcat (число оборотов). С учетом этих предположений они вывели уравнение

(2)

Концепция фермент-субстратного комплекса является краеугольным камнем ферментативной кинетики и лежит в основе наших представлений о механизмах ферментативного катализа. В честь ученого, который ввел это понятие, комплекс субстрата с ферментом, образованный без участия ковалентных связей, называют комплексом Михаэлиса.

 

3. Анализ кинетической кривой.

Основной трудностью при обработке результатов ферментативных реакций является то, что эти реакции протекают во времени нелинейно. Одна стадия реакции сменяется другой. В зависимости от конкретного фермента, выбранных условий реакции и других факторов, различные реакционные стадии проявляются более или менее отчетливо. Таким образом, только полное понимание основных принципов ферментативного катализа помогает избежать ошибок в толковании результатов ферментативной реакции.

К счастью, огромное множество ферментативных реакций может быть описано с помощью одного простого уравнения Михаэлиса-Ментен. Однако первым ограничением является то, что это уравнение было выведено для необратимой односубстратной реакции, тогда как большинство ферментативных реакций обратимы и протекают с участием двух или нескольких субстратов, кофакторов и коферментов. Учет всех этих факторов усложняет зависимость скорости от концентрации субстрата, но при определенных условиях ее можно свести к уравнению Михаэлиса-Ментен. На рис. 1 представлена типичная кинетическая кривая, отражающая ход ферментативной реакции.

 

Рис. 1. Фазы стандартной кинетической кривой, отражающей ход ферментативной реакции.

 

Данную кинетическую кривую можно условно разделить на 3 участка. Строго говоря, реакция начинается с быстрой предстационарной фазы, продолжительность которой составляет микро- или миллисекунды, поэтому экспериментатор ее не замечает. На данной стадии концентрация фермент-субстратного комплекса увеличивается от нулевой до стационарной – т.е. постоянной концентрации комплекса, наблюдаемой в стационарной фазе. Продолжительность стационарной фазы зависит от соотношения концентраций субстрата и фермента. Если концентрация субстрата мала, то скорость реакции имеет первый порядок по субстрату, и практически сразу по окончании предстационарной фазы наступает 3 фаза – исчерпание субстрата. В данном случае сложно выделить линейный участок. В таком случае снижение концентрации фермента или увеличение концентрации субстрата позволяет продлить линейный участок, по которому и определяют начальную скорость реакции.

По одной кинетической кривой можно построить зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Для этого при различных концентрациях субстрата (продукта) проводят касательные к кинетической кривой и по тангенсу угла наклона определяют скорость реакции при данной концентрации субстрата (продукта) (рис. 2).

 

Рис. 2. Определение скорости реакции из полной кинетической кривой методом касательных.

 

Однако следует учитывать, что накопление продукта может замедлять реакцию как в результате ингибирования фермента, так и за счет обратной реакции, поэтому более правильным подходом будет определение начальных скоростей при различных концентрациях субстрата.

 

4. Проведение ферментативного анализа.

Для характеристики фермента необходимо выбрать удобный метод анализа. Основной проблемой при разработке метода анализа является выбор детектируемого сигнала, соответствующего либо образованию продукта, либо конверсии субстрата.

Необходимо выбрать параметр, который удобно детектировать, и по которому продукт существенно отличается от субстрата. Например, косубстрат многих оксидоредуктаз НАД (или НАДФ) имеет характерную полосу поглощения при 260 нм, которую легко детектировать на спектрофотометре. Но примерно в этой же области находится полоса поглощения его продукта превращения – НАДН. В результате, несмотря на наличие сильного поглощения, по данному сигналу практически невозможно следить за ходом реакции. Однако при образовании НАДН появляется новая полоса поглощения при длине волны 340 нм. И хотя интенсивность этой полосы ниже, чем полосы при 260 нм, зато субстрат реакции (НАД) в этой области не дает никакого сигнала. И так, выбор метода детекции должен определяться не наибольшей интенсивностью сигнала, а наибольшим различием в сигналах субстрата и продукта.

За ходом реакции можно следить по изменению оптической плотности при выбранной длине волны (спектрофотометр), по степени отражения поляризованного света (поляриметр), по дисперсии оптического вращения, по способности связывать красители или с помощью ферментативного превращения продукта в легко детектируемое вещество.

После выбора основного метода анализа следует определить оптимальные условия проведения эксперимента. Понятно, что результаты анализов, выполненных в разное время и в разных местах, можно сравнивать лишь при полном совпадении условий. Поскольку ферменты весьма чувствительны к воздействию различных факторов, необходимо поддерживать постоянные условия реакции. Недоучет хотя бы одного из них может вызвать серьезные отклонения результатов. Рассмотрим критерии выбора оптимальных параметров.

4.1. рН

Стандартного оптимального значения рН для всех ферментов не существует, но большинство ферментов предпочитают нейтральный рН. Иногда выбор рН обусловлен не максимальной активностью фермента, а удобством регистрации сигнала.

4.2. Ионная сила и буферные растворы

Часто используют 0,1 М буферные растворы, ионная сила которых значительно ниже внутриклеточной. 1М ионная сила может вызывать инактивацию фермента. Однако чаще дестабилизация ферментов связана с природой буферного раствора, а не с молярностью. Многие ферменты стабильны в фосфатном буфере, хотя следует учитывать его способность связывать катионы. Трис может вызывать инактивацию некоторых ферментов. Следует учитывать диапазон рН, в котором выбранный буфер обладает достаточной емкостью. Иногда в ходе реакции рН изменяется, поэтому приходится контролировать рН.

4.3. Температура

В отличие от рН-зависимости не существует температурного оптимума активности ферментов, хотя и на температурной зависимости обнаруживается максимум активности. Однако в данном случае максимум является результатом наложения двух различных процессов. При повышении температуры возрастает скорость химической реакции в соответствии с уравнением Аррениуса

(3)

либо теорией переходного состояния

(4)

Это относится и к ферментативным реакциям, однако при повышении температуры происходит денатурация фермента. Сочетание двух зависимостей выражается в виде кривой с определенным максимумом активности. Однако надо учитывать то, что положение максимума зависит от времени нахождения фермента при данной температуре, поэтому лучше проводить эксперимент при температуре значительно ниже той, при которой достигается максимальная скорость реакции. При слишком низких температурах скорость реакции низкая, и для проведения анализа требуется более высокая концентрация фермента. Поэтому приходится принимать компромиссное решение.

4. 4. Специфические компоненты

Кроме субстрата и буферного раствора для проведения некоторых ферментативных реакций требуются разнообразные специфические компоненты, такие как кофакторы, которые либо напрямую задействованы в катализе, либо стабилизируют фермент. С одной стороны одно- и двухвалентные катионы металлов нейтрализуют избыточные заряды на поверхности белка и обеспечивают определенные виды связей. С другой стороны, ионы тяжелых металлов могут участвовать в окислительно-восстановительных процессах, особенно с участием тиогрупп, что может приводить к изменению структуры белка. Таким образом, добавление подобных ионов небходимо для одних ферментов, но губительно для других. В последнем случае для удаления ионов в среду добавляют комплексообразователи типа ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) или ЭГТА (этиленгликоль-бис-(β-аминоэтилэфир)-N,N,N,N-тетраацетат). Например, одним из компонентов пируватдегидрогеназного комплекса является пируватдегидрогеназа, которая активна только в присутствии ионов Mg2+, однако для важной для катализа дитиогруппы в молекуле другого компонента этого комплекса – дигидролипоилдегидрогеназы – двухвалентные ионы губительны. Иными словами, для поддержания стабильности одного и того же ферментного комплекса нужны противоречащие друг другу условия. Mg2+ нужны для нейтрализации фосфатных групп в ферментативных реакциях с участием нуклеотидов (АТР). Са2+ необходимы некоторым протеазам и киназам для осуществления катализа и подержания структуры. Реагенты с тиогруппами, такие как меркаптоэтанол или более эффективные реагенты Клеланда – дитиотреитол (ДТТ) и дитиоэритрит (ДТЭ), - добавляют в концентрации 0,1-0,2 мМ для защиты сульфгидрильных групп.

Частой причиной нестабильности и инактивации ферментов является протеолиз. Даже очень хорошо очищенные ферментные препараты могут содержать следовые количества протеаз, которые присутствуют во всех клетках. Протеазы действуют в очень низких концентрациях, а очищенные белки особенно чувствительны к их действию, поскольку другие субстраты протеаз отсутствуют, а все возможные ингибиторы удалены при очистке. При переносе белковой молекулы из клеточной среды в буферный раствор может изменяться ее конформация, в результате чего становятся доступными сайты для расщепления протеазами. Для защиты от протеаз в среду добавляют ингибиторы протеаз. Некоторые из них защищают от протеаз трех основных классов, например α2-макроглобулин. Лейпептин (0,5 мкг/мл), TLCK=ТЛХК (тозиллизинхлорометилкетон, 0,05 мг/мл) и ТРСК=ТФХК (тозилфенилаланинхлорометилкетон, 0,1 мг/мл) действуют как против сериновых, так и против цистеиновых протеаз. В справочнике биохимика написано, что ТЛХК ингибирует трипсин, но не химотрипсин, а ТФХК наоборот.

Ингибитором сериновых протеаз является фенилметилсульфонидфторид (PMSF, 0,1 мг/мл), который связывается с ними ковалентно, подобно суицидному субстрату. Он плохо растворим в воде, поэтому запасной раствор готовят в ацетоне. В водных растворах PMSF быстро разлагается (время полураспада 30 мин). Необратимой инактивации подвергается лишь та часть молекул протеаз, которые прореагировали немедленно, остальные остаются активными, поэтому реагент необходимо вносить снова.

К ингибиторам цистеиновых протеаз относятся E-64(N-[N-(L-3-транс-карбоксиран-2-карбонил)-L-лейцил)-агматин, 0,01 мг/мл) или ингибитор кальпаина I (N-ацетил-Leu-Leu-норлейциналь, 0,01 мг/мл).

Действие металлопротеиназ эффективно подавляется в присутствии комплексообразователей, таких как ЭДТА или ЭГТА, селективно связывающих Ca2+. Однако эти вещества инактивируют и все другие металлозависимые ферменты.

Часто оказывается, что ферменты менее стабильны в разбавленных растворах, поэтому в растворы ферментов добавляют инертный бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл). Такими же защитными свойствами обладают глицерин и сахароза. Это может объясняться тем, что введение данных веществ по физико-химическим показателям имитирует внутриклеточную среду. Кроме того, таким образом достигается определенная защита от вредного воздействия ионов тяжелых металлов, кислорода и протеаз.

4.5. Концентрация компонентов и методические замечания

Концентрации компонентов должны быть достаточными, чтобы позволить зарегистрировать протекание реакции, но не слишком высокими, чтобы не оказать отрицательного влияния на ее течение. Обычно концентрации компонентов выше 10 мМ оказываются неприемлемыми. Например, константа Михаэлиса каталазы для ее субстрата перекиси водорода составляет 25 мМ, но такая концентрация Н2О2 очень быстро инактивирует фермент.

При проведении ферментативного анализа все компоненты (субстраты, косубстраты или коферменты) должны присутствовать в насыщающих концентрациях, чтобы небольшие вариации абсолютных значений концентраций не влияли на скорость реакции, которая зависела бы только от варьируемого параметра, обычно – концентрации фермента. Поскольку полное насыщение достигается при бесконечно больших концентрациях компонентов, их количество в реакционной смеси должно хотя бы в 10 раз превосходить значение Км (при этом достигается лишь 91% насыщения). Однако, некоторые ферменты ингибируются высокими концентрациями субстратов.

Комплексообразующие вещества типа ЭДТА должны быть взяты в избытке по отношению к тем ионам, которые необходимо связать, обычно в концентрации 1 мМ. Следует учитывать, что в некоторых реактивах могут содержаться добавки, такие как сульфат аммония, детергенты, и др, которые могут нарушать течение реакции либо за счет непосредственного взаимодействия с ферментом, либо путем изменения условий среды. Иногда может происходить спонтанное изменение наблюдаемых параметров, которое вызывает изменение регистрируемого сигнала (окисление кислородом). Если эти реакции нельзя подавить, следует вносить соответствующие поправки.

Наибольшую ошибку в результат измерений вносит вносит приготовление растворов с заданными концентрациями. Иногда некоторые вещества вводят прямо в реакционную смесь в фотометрической кювете.

+ быстро

- при добавлении разных объемов изменяется объем смеси, точность пипеток на малые объемы ограничена, использование разных пипеток вносит дополнительную ошибку.

Лучше готовить серию разведений для различных веществ и добавлять в реакционную смесь каждый раз один и тот же объем раствора. Этот способ более предпочтителен по сравнению с последовательным разведением, поскольку в последнем случае ошибка, допущенная при приготовлении раствора в одной пробирке, распространяется далее на все последующие.

 

5. Активность фермента.

И так, скорость ферментативной реакции определяют по начальному линейному участку кривой, построенной при стандартных условиях в присутствии насыщающих концентраций всех субстратов. Скорость реакции v = -d[S]/dt = d[P]/dt рассчитывают по тангенсу угла наклона касательной, проведенному к начальному участку полной кинетической кривой (рис. 3).

 

Рис. 3. Определение начальной скорости реакции методом касательных.

Официальной единицей измерения ферментативной активности является катал. 1 катал (кат) – это активность фермента, превращающего 1 моль субстрата в секунду. Но поскольку это слишком крупная единица, она практически не используется. Чаще ферментативную активность выражают в международных единицах – МЕ (в русской литературе) или IU (в зарубежной литературе). 1 IU – активность фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата в мин.

Общую активность фермента находят, умножая активность в единице объема (1 мл) на общий объем раствора. Удельную ферментативную активность получают при делении ферментативной активности на массу белка. Удельная активность характеризует степень очистки фермента.

Каталитическая константа в простейшем случае (схема 1) характеризует скорость распада фермент-субстратного комплекса. В многостадийных схемах kcat представляет собой нижний предел для констант скоростей, характеризующих промежуточные стадии превращения субстрата и определяется по формуле:

kcat = Vmax/[E]0 (5)

Число оборотов фермента показывает число молекул субстрата, превращенных в активном центре фермента за 1 секунду (для мономерных ферментов равно kcat). Очевидно, что для расчета числа оборотов в формуле 5 вместо концентрации фермента должна присутствовать концентрация активных центров. Ферменты существенно различаются по числу оборотов: для сукцинатдегидрогеназы число оборотов равно 20, для холинэстеразы – 1500, для каталазы – 90 тыс, а для карбоангидразы – 600 тыс.

Специфичность катализа оценивают по отношению каталитической константы к константе Михаэлиса (kkatм). Эволюционно совершенный фермент, обеспечивающий максимально возможную скорость реакции, должен иметь максимальное значение kcatм, представляющее собой определяемую диффузией константу скорости столкновений фермента и субстрата (108-109 М-1с-1) и Км>[S]. То есть ферменты эволюционируют в сторону увеличения максимальной скорости реакции: сильного связывания переходного состояния и слабого связывания субстрата (Фершт).

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Компьютеры фон Неймана | Тема: Предмет аналітичної геометрії. Пряма на площині
Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-01-15; Просмотров: 859; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.064 сек.