Выращивание ЭСК in vitro

Для исследователей ЭСК - это пособие для расшифровки работы генома (особенно в период раннего эмбриогенеза и органогенеза). Необходимо напомнить, что изучение эмбриогенеза человека ограничено по биоэтическим соображениям. Постимплантационный эмбриогенез млекопитающих мышей, крыс, других лабораторных млекопитающих имеет существенные отличия. Во многих ситуациях ЭСК остаются единственной экспериментальной возможностью для моделирования событий, происходящих в зародыше человека после имплантации. Таким образом, ЭСК человека и млекопитающих – незаменимый путь для изучения аномалий постимплантационного развития зародышей. А самое главное, ЭСК- незаменимое средство поиска лекарства против старения.

Для ЭСК характерно два варианта запрограммированного поведения в культуре:
1) незрелые ЭСК длительно размножаются в присутствии фидерного слоя клеток и ростовых факторов.

2) после наработки массы недифференцированных клеток, рамножение клеток останавливают, изменяя условия культивирования. Начинается дифференцировка клеток (желательно в один тип специализированных клеток).

ЭСК назвали "лабораторными лошадками" регенерации (Petit-Zeman, 2001), потому что регенерация органов практически невозможна за счет резерва собственных дифференцированных клеток. ЭСК сохраняются in situ ("на месте") и повторяют фрагменты эмбриогенеза в тканях взрослого организма. Некоторые линии ЭСК человека удавалось пассировать без изменения фенотипа более 2 лет. Такие культуры прошли 300-450 циклов удвоения клеток без возникновения анеуплоидии или опухолей. При устранении фидера, ростовых факторов, а также после добавления сигналов начиналась медленная многоэтапная дифференцировка ЭСК в популяции необратимо специализированных клеток. Интересно, что дифференцировка ЭСК в нейроны, кардиомиоциты идет за 10-15 дней, тогда как аналогичные процессы линейного созревания клеток в эмбрионе идут 5-7 нед (Kawasaki H., Suemori H., Mizuseki K. et al.,2002). В последнее время стали использовать сигналы фидерного слоя клеток для ускоренной дифференцировки клеток в культуре.

Рост ЭСК в культуре идет клонами. В отличие от обычного экспоненциального размножения клеток в культуре, клон не растет, а самообновляется. Только в клоне сохраняется микроокружение, позволяющее стволовым клеткам удерживать необычно высокую генетическую потенцию. Эта особая геномика клеток сохраняется и воспроизводится только в плотной сфере. Каждая культура ЭСК имеет варьирующую долю клеток в суспензионных агрегатах (сферах). Одиночные клетки, покидая клон, неизбежно дифференцируются. Лишь агрегаты составляют суммарное пространство плюрипотентных клеток, остальные клетки специализируются под влиянием микроокружения. Большинство новых фенотипов возникает по периферии клонов. В каждом клоне клетки одновременно дифференцируются в разные фенотипы, подтверждая важность микроокружения.

Известно, что в первичной культуре эмбриобласта (эпибласта) обязательно сохраняют первичные агрегаты клеток при получении линий ЭСК (Talbot N.C., Carrett W.M., 2001) Одноклеточные суспензии эпибласта/эмбриобласта зародышей человека и обезьяны практически не выживали в первичной культуре. Внешние слои клона более активно пролиферировали в среде с ростовыми факторами (LIF, SCF, IL-6, bFGF, EGF,TGF-alpha). Состав и оптимальные концентрации факторов пролиферации подбираются эмпирически в каждой культуре. Более продвинутые клетки по периферии сфер гибли в селективной среде, предназначенной для выживания наименее зрелых популяций. Когда клеточные агрегаты достигали размера 30-50 клеток, наступало равновесие между пролиферацией и апоптозом. Каждый клон – это микромодуль самообновления клеток в постоянном миниобъеме. Репертуар прогениторных клеток постоянно меняется без изменения самого стволового пространства. Провизорные клоны сменяются дефинитивными клетками за счет множественных циклов самообновления клеток. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток предотвращали повторным диспергированием агрегатов. Клоногенность – это способность культуры генерировать разную численность клон-инициирующих клеток на мл. Пока клоногенность существующих линий находилась на уровне 1-2 % (Pera M.F., 2001). Сигналы, запускающие инициацию клонов, практически не изучены. Выявлены варианты ЭСК, в которых исходно экспрессированы разные наборы генов, отвечающих за два главных качества клона: 1) плюрипотентность генома 2) самообновление прогениторных клеток (Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D.J.,1997).

Сравнительный анализ показал, что линии ЭСК человека имеют существенные отличия от ЭСК животных по набору параметров: выживаемость и чувствительность к разным условиям культивирования, зависимость от митогенов и факторов апоптоза, факторов цитодифференцировки и сигналов, контролирующих функциональное созревание и поведение клеток in vitro (Carpenter M.K., Inokuma M.S., Denham J. et al., 2001). Поэтому данные, получаемые на ЭСК мышей, с большими оговорками экстраполируются на человека. Исследования генома плюрипотентных клеток животных, включая эффект лекарств, имеют сигнальное, но не решающее значение, особенно в областях прикладной медицины. Здесь нужны прямые эксперименты на ЭСК человека.

Дата добавления: 2014-01-15