Способы и средства экспериментирования

Методы исследования

Как и всякая наука, физиология начинала познание предме­та своего изучения с простого наблюдения и умозрительных, не всегда верных догадок о внутренней сущности наблюдаемых явлений.

Затем по мере развития технических средств регистра­ции и возможности вмешательства в жизнь организма главным способом физиологического исследования становится экспери­мент и, наконец, накопленные в результате экспериментов зна­ния закономерностей изучаемых явлений жизни организма со­здают пока еще только предпосылки для становления методов теоретической физиологии.

В настоящее время эксперимент является основным мето­дом, посредством которого физиология ЦНС получает, расширяет и углубляет сведения о работе головного и спинного мозга.

Для изучения функций организма используют различные способы исследова­ния их деятельности. Они могут быть сведены в 4 боль­шие группы методов:

1) подавление функции вплоть до ее вы­ключения;

2) стимуляция функций;

3) регистрация электриче­ской активности;

4) моделирование.

Подавление функции вплоть до ее полного выключения осу­ществляют во многих случаях путем хирургического удаления (экстирпации) органа или его частей. Таким способом опреде­ляли распределение зрительной, слуховой и других функций между областями коры головного мозга. Подавление функции может быть вызвано также химически – фармакологическими средствами избирательного действия. Так, атропиновая блока­да импульсов от блуждающего нерва выявляет его роль в ин­нервации сердца. Используют и такие способы выключения деятельности органа, как его денервация, холодовое блокирова­ние и другие средства.

Примером кратковременного выключения функции может служить прекращение деятельности коры головного мозга на не­сколько минут при прохождении волны подавления электриче­ской активности (распространяющаяся депрессия Леао), вы­званной химическим, электрическим или иным раздражением.

Стимуляция функций путем раздражения может осущест­вляться разными физическими и химическими раздражителями. Среди них особое место занимает электрический ток, получив­ший самое широкое распространение благодаря возможности точно дозировать его силу, время действия, место приложения, а также повторно применять, не повреждая ткани. Эти преиму­щества электрического раздражителя по сравнению с химиче­скими, механическими, тепловыми и другими определяются его ионной природой и связанными с ней свойствами. Основой используемых в современном физиологическом эксперименте электрических стимуляторов служит электронный генератор, импульсы которого могут быть любой формы, длительности (от миллиардных долей секунды до практически постоянного тока) и частоты (от одиночных импульсов до десятков тысяч в секунду). Можно подавать импульс за импульсом в опреде­ленной последовательности, например, уменьшая интервал между ними для измерения времени восстановления возбуди­мости. Многоканальные стимуляторы позволяют одновременно или с заданным отставанием раздражать различные структуры изучаемых тканей и органов.

Регистрация электрических потенциалов (микроэлектродная техника, метод вызванных потенциалов, ЭЭГ) Методы регистрации электрических потенциалов оказываются практически единственным и потому незаменимым средством прямого наблюдения за быстрыми изменениями состояния от­дельных нервных клеток, проведением импульсов по нервам, возбуждением нервных центров и т. п., поэтому в физиологии нервной системы эти методы занимают особое место.

К достоинствам метода регистрации электрических потен­циалов относится возможность получить информацию о функ­ционировании исследуемого органа без какого бы то ни было вмешательства и нарушения его деятельности.

Элект­рофизиологические методы исследования позволяют наблюдать течение физи­ологических процессов в диапазоне от долей миллисекунды до нескольких дней.

Пропустим значительный отрезок истории и обратимся к XIX столетию. К этому времени уже появились первые физические приборы (струнные гальванометры), которые позволяли исследо­вать слабые электрические потенциалы от биологических объектов. В Манчестере (Англия) Г. Катон впервые поместил электроды (ме­таллические проволочки) на затылочные доли головного мозга собаки и зарегистрировал колебания электрического потенциала при освещении светом ее глаз. Подобные колебания электрическо­го потенциала сейчас называют вызванными потенциалами и ши­роко используют при исследовании мозга человека. Это открытие прославило имя Катона и дошло до нашего времени, но совре­менники замечательного ученого глубоко чтили его как мэра Ман­честера, а не как ученого.

В России подобные исследования проводил И. М. Сеченов: ему впервые удалось зарегистрировать биоэлектрические колебания от продолговатого мозга лягушки. Другой наш соотечественник, про­фессор Казанского университета И. Правдич-Неминский изучал биоэлектрические колебания мозга собаки при различных состоя­ниях животного – в покое и при возбуждении. Собственно, это были первые электроэнцефалограммы. Однако мировое признание получили исследования, проведенные в начале XX века шведским исследователем Г. Бергером. Используя уже более совершенные приборы, он зарегистрировал биоэлектрические по­тенциалы головного мозга человека, которые теперь называют элек­троэнцефалограммой. В этих исследованиях впервые был зарегист­рирован основной ритм биотоков мозга человека – синусоидальные колебания с частотой 8-12 в секунду, который получил название альфа-ритма. Это можно считать началом современной эры иссле­дования физиологии головного мозга человека.

Современные методы клинической и экспериментальной элек­троэнцефалографии сделали значительный шаг вперед благодаря применению компьютеров. Обычно на поверхность скальпа при клиническом обследовании больного накладывают несколько де­сятков чашечковых электродов. Далее эти электроды соединяют с многоканальным усилителем. Современные усилители очень чув­ствительны и позволяют записывать электрические колебания от мозга амплитудой всего в несколько микровольт (1 мкВ =10^-3В). Далее достаточно мощный компьютер обрабатывает ЭЭГ по каж­дому каналу. Психофизиолога или врача, в зависимости от того, исследуется мозг здорового человека или больного, интересуют многие характеристики ЭЭГ, которые отражают те или иные сто­роны деятельности мозга, например ритмы ЭЭГ (альфа, бета, тета и др.), характеризующие уровень активности мозга. Так, например, во время хирургической операции современные анестезиологи наблюдают за глубиной наркоза больного.

Многие исследования нейробиологи проводят на достаточно простых объектах: один из классических объектов современной нейрофизиологии – головоногий моллюск кальмар и нервное волокно (так называемый гигантский аксон), на котором были выполнены классические исследования по фи­зиологии возбудимых мембран.

В последние годы для этих целей все шире применяют прижиз­ненные срезы головного мозга новорожденных крысят и морских свинок и даже культуру нервной ткани, выращенную в лаборатории.

Электрофизиологические методы позволяют проводить исследование механизмов функционирова­ния отдельных нервных клеток и их отростков. Например, у головоногих моллюсков (кальмара, каракатицы) имеются очень тол­стые, гигантские аксоны (диаметром 0,5-1 мм), по которым из головного ганглия передается возбуждение на мускулатуру ман­тии. Молекулярные механизмы возбуждения исследуют­ся на этом объекте. У многих моллюсков в нервных ганглиях, заме­няющих у них головной мозг, есть очень большие нейроны – ди­аметром до 1 мм. Эти нейроны являются излюбленными объектами при изучении работы ионных каналов, открытие и зак­рытие которых управляется химическими веществами. Ряд вопро­сов передачи возбуждения от одного нейрона другому исследуется на нервно-мышечном соединении – синапсе (синапс в переводе с греческого означает контакт). Эти синапсы по размерам в сотни раз больше подобных синапсов в головном мозге млекопитающих. Здесь протекают весьма сложные и до конца не изученные про­цессы.

Например, нервный импульс в синапсе приводит к выбро­су химического вещества, вследствие действия которого возбуж­дение передается на другой нейрон. Исследование этих процессов и их понимание лежат в основе целой современной индустрии про­изводства лекарственных средств и других препаратов. Список воп­росов, которые может решать современная нейробиология, беско­нечно велик. Некоторые примеры мы рассмотрим далее.

Для регистрации биоэлектрической активности нейронов и их отростков применяют специальные приемы, которые называются микроэлектродной техникой. Микроэлектродная техника в зави­симости от задач исследования имеет много особенностей. Обычно применяют два типа микроэлектродов – металлические и стек­лянные.

Рис.5. Микроэлектроды на фоне монеты

Металлические микроэлектроды часто изготавливают из вольфрамовой проволоки диаметром 0,3-1 мм. На первом этапе нарезают заготовки длиной по 10-20 см (это определяется глубиной, на которую будет погружен микроэлектрод в мозг исследуемого животного). Один конец заготовки электролитическим мето­дом затачивают до диаметра 1-10 мкм. После тщательной промыв­ки поверхности в специальных растворах ее покрывают лаком для электрической изоляции. Самый кончик электрода остается не­изолированным (иногда через такой микроэлектрод пропускают слабый толчок тока, чтобы дополнительно разрушить изоляцию на самом кончике).

Для регистрации активности одиночных нейронов микроэлек­трод закрепляют в специальном манипуляторе, который позволя­ет продвигать его в мозге животного с высокой точностью. В зависимости от задач исследования манипулятор может крепить­ся на черепе животного или отдельно. В первом случае это очень миниатюрные устройства, которые получили название микрома­нипуляторов. Характер регистрируемой биоэлектрической актив­ности определяется диаметром кончика микроэлектрода. Напри­мер, при диаметре кончика микроэлектрода не более 5 мкм можно зарегистрировать потенциалы действия одиночных нейронов (в этих случаях кончик микроэлектрода должен приблизиться к исследуе­мому нейрону на расстояние около 100 мкм). При диаметре кончи­ка микроэлектрода больше 10 мкм одновременно регистрируется активность десятков, а иногда сотен нейронов (мультиплай-активность).

Другой широко распространенный тип микроэлектродов изго­тавливают из стеклянных капилляров (трубочек). Для этой цели используются капилляры диаметром 1-3 мм. Далее на специаль­ном устройстве, так называемой кузнице микроэлектродов, вы­полняют следующую операцию: капилляр в средней части разог­ревают до температуры плавления стекла и разрывают. В зависимости от параметров этой процедуры (температуры нагрева, величины зоны нагрева, скорости и силы разрыва и пр.) получают микропипетки с диаметром кончика до долей микрометра. На следующем этапе мик­ропипетку заполняют специальным раствором соли и полу­чают микроэлектрод. Кончик такого микроэлектрода можно вводить внутрь нейрона (в тело или даже в его отростки), не сильно повреж­дая его мембрану и сохраняя его жизнедеятельность.

Моделирование приобрело значение метода исследования физиологических функций в связи с развитием кибернетики. В широком смысле слова моделью функции может быть ее логическая модель, математическая модель и конструкция макета, вос­производящего некоторые проявления моделируемой функции в своих действиях. Однако в моделях воспроизводятся лишь некоторые искусственно выделенные среди остальных свойства прототипа, а не весь он в своем многообразии свойств, поэтому моделирование неизбежно связано с неко­торым упрощением задачи исследования сложной функции и при этом нуждается в четком определении граничных усло­вий применимости модели.

Современные:

· Томография (магнитно-резонансная – послойно; позитронно-эмиссионная – имеет еще более высокое разрешение – в мозговой кровоток позитрон-излучающего изотопа – трехмерный образ). Но при томографии не улавливаются многие скоростные процессы в мозге, для которых подходят больше все же электрофизиологические методы.

Рис.6. Компьютерная томография

Рис.7. Томография головного мозга

Методы исследования головного мозга человека постоянно со­вершенствуются. Так, современные методы томографии позволя­ют увидеть строение головного мозга человека, не повреждая его. Головной мозг облучают электромагнитным полем, применяя для этого специальный маг­нит. Под действием магнитного поля диполи жидкостей мозга (на­пример, молекулы воды) принимают его направление. После сня­тия внешнего магнитного поля диполи возвращаются в исходное состояние, при этом возникает магнитный сигнал, который улав­ливается специальными датчиками. Затем это эхо обрабатывается с помощью мощного компьютера и методами компьютерной гра­фики отображается на экране монитора. Благодаря тому, что внешнее магнитное поле, создаваемое внешним магнитом, можно сде­лать плоским, таким полем как своеобразным «хирургическим ножом» можно «резать» головной мозг на отдельные слои. На эк­ране монитора ученые наблюдают серию последовательных «сре­зов» головного мозга, не нанося ему никакого вреда. Этот метод позволяет исследовать, например, злокачественные образования головного мозга.

Еще более высоким разрешением обладает метод позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Исследование основано на введе­нии в мозговой кровоток позитрон-излучающего короткоживущего изотопа. Данные о распределении радиоактивности в мозге со­бираются компьютером в течение определенного времени сканирования и затем реконструируются в трехмерный образ. Ме­тод позволяет наблюдать в головном мозге очаги возбуждения, например, при продумывании отдельных слов, при их проговари-вании вслух, что свидетельствует о его высоких разрешающих воз­можностях.

Вместе с тем многие физиологические процессы в головном мозге человека протекают значительно быстрее тех воз­можностей, которыми обладает томографический метод. В исследованиях ученых немаловажное значение имеет финансовый фак­тор, т. е. стоимость исследования. К сожалению, томографические методы очень дороги: одно исследование мозга больного человека может стоить десятки тысяч рублей.

· Изучение мозгового кровотока

Метод Кети–Шмидта, позволяет количественно оценить в целом усредненный мозговой кровоток путем определения скорости насыщения ткани головного мозга инертным газом (обычно после вдыхания небольших количеств закиси азота).

Динамическая сцинтиграфия (метод функциональной визуализации, заключающийся во введении в организм радиоактивных изотопов и получении изображения путём определения испускаемого ими излучения) мозга основана на внутривенном введении радиофармпрепарата (99mTc) и немедленной регистрации прохождения максимальной массы радионуклида (болюса) по сосудам головного мозга. График прохождения болюса позволяет провести сравнительную оценку кровенаполнения полушария головного мозга и его отдельных областей. К динамической радионуклидной диагностике относится также изучение мозгового кровотока с помощью радиоактивного газа ксенона (133Хе) или газообразного водорода, которые вводят внутриартериально, внутривенно или ингаляционно. Метод позволяет определить объемный кровоток отдельно в сером и белом веществе по полушариям и различным областям головного мозга на основании кривых клиренса (скорости очищения).

Прямым (но не количественным) методом оценки мозгового кровотока является метод определения изменений объема крови в поверхностно расположенных сосудах головного мозга с помощью радионуклидов, которыми метят белки плазмы крови.

Радиоизотопные исследования с помощью 133Хе могут проводиться в комплексе с компьютерной томографией мозга, что дает возможность получать графическое изображение регионарного кровотока в мозге. Позитронная эмиссионная томография мозга позволяет оценивать не только регионарный мозговой кровоток, но и метаболические (окислительно-восстановительные) процессы в ткани мозга.

Реоэнцефалография является косвенным методом исследования мозгового кровотока, при котором по пульсовым колебаниям электрического сопротивления различных участков мозга определяют состояние эластико-тонических свойств сосудистой стенки, оценивают пульсовое кровенаполнение и в ряде случаев – состояние венозного кровообращения.

Транскраниальная ультразвуковая допплерография – метод, основанный на эффекте Допплера, позволяющий получать информацию о проходимости внутримозговых сосудов, линейной скорости и направлении кровотока в них.

Рис.8. Изучение мозгового кровотока с помощью реоэнцефалограммы

· Термография

Термография – метод регистрации инфракрасного излучения головного мозга в целях диагностики различных заболеваний.

· Методы нейропсихологии

Еще одно направление исследования головного мозга человека возникло в годы Второй мировой войны – это нейропсихология. Одним из основоположников этого подхода был профессор Мос­ковского университета Александр Романович Лурия. Метод пред­ставляет собой сочетание приемов психологического обследова­ния с физиологическим исследованием человека с поврежденным головным мозгом.

Дата добавления: 2014-01-20