Проводка» образцов для микроскопического исследования

Глутаровый альдегид

Глутаровый альдегид – диальдегид, реагирует с аминогруппами, сульфгидрильными группами и, возможно, с ароматическими циклическими структурами. «Сшивает» молекулы сильнее, чем формальдегид, поэтому менее предпочтителен для иммуногистохимии. Фиксаторы на основе ГА медленнее проникают в ткани, чем формалин, поэтому могут возникнуть артефакты на основе диффузии растворимых белков и нарушения структуры.

В современных микроскопических исследованиях используют разнообразные фиксаторы, в зависимости от задач исследования.

Процесс подготовки материала для микроскопического исследования, помимо фиксации, обычно включает в себя обезвоживание материала, пропитку его заливочной средой и заливку. Задача – сделать материал пригодным для изготовления достаточно тонких срезов для окрашивания и просмотра в микроскопе. В качестве заливочной среды для световой микроскопии преимущественно используется парафин, иногда – целлоидин и желатин. В последнее время появились синтетические заливочные среды, успешно заменяющие парафин, часто изготовленные на его основе. Абсолютное большинство методов специфического окрашивания разработано для парафиновых срезов.

Итак, после фиксации мы имеем образец, пропитанный водным раствором фиксатора. Для заливки в парафин, который не смешивается с водой, нужно избавиться от воды и пропитать образец парафином. Для этого проводят обезвоживание образца в растворах этилового спирта возрастающей концентрации (от 30% до абсолютного), затем выдерживают в смеси абсолютного спирта с ксилолом или в изопропиловом (бутиловом) спирте, затем –в ксилоле, смеси ксилола с парафином и, наконец, в парафине. Пропитка парафином проводится при температуре 56С. Разогретый образец помещают в формочку и заливают разогретым парафином. После затвердевания образец монтируют на подставку и блок готов для резки. Нужно иметь в виду, что для гистологических целей подходит не каждый парафин, существуют свои особенности его подготовки. От качества парафина во многом зависит качество срезов.

Для проводки материала используют плотно закрывающуюся посуду, чтобы не было испарения растворов. При ручной проводке образцы перекладывают из раствора в раствор, и проводка занимает, в зависимости от величины образцов, от суток до недели. В лабораториях обычно используют автоматы разной модификации, в которых происходит вращение сосудов, которое обеспечивает перемешивание жидкости. Время проводки сокращается до суток. Существуют ускоренные схемы проводки.

Готовые парафиновые блоки могут храниться неограниченное время. Парафиновые срезы готовят на микротомах с помощью стального или (реже) стеклянного ножа Толщина срезов зависит от свойств самого парафинового блока, ткани и от модели микротома и квалификации работника. Последняя имеет достаточно большое значение. В самом лучшем случае толщина парафинового среза составляет около 3 мкм, что позволяет видеть один слой клеток в срезе. На практике обычно готовят срезы толщиной 5-8 мкм. Срезы помещают на предметное стекло, которое может быть покрыто адгезивом, обычно – яичным белком. Это нужно, что бы срезы не отваливались при окраске.

Парафиновые срезы на стекле могут храниться годами, но обычно их окрашивают через день-два после изготовления. Перед окраской проводится обратная проводке процедура – депарафинирование. Это нужно для того, чтобы клетки снова оказались водопроницаемыми, а их структуры стали доступными для красителей. Депарафинирование проводят в обратном порядке: сначала растворяют парафин в ксилоле, затем срезы помещают последовательно в растворы этилового спирта понижающейся концентрации до 30%, затем – в дистиллированную воду. Срезы готовы к окрашиванию.

Окрашивание производят вручную, помещая стекло в растворы разных химикатов, или нанося красящие растворы на стекло пипеткой. Существуют автоматы для окрашивания срезов, но их эксплуатация может быть очень дорогой, поскольку нужно заливать большие объемы красителей, которые обычно дороги. Окрашивание парафиновых срезов позволяет выявить самые разнообразные компоненты и структуры клетки. Существует множество разнообразных красителей, обладающих способностью окрашивать клеточные и тканевые структуры. Значительный прорыв в окрашивании гистологических срезов был сделан при внедрении в практику анилиновых красителей.

Наиболее распространенным методом обзорного окрашивания гистологических препаратов, когда видны все типы клеток, является окрашивание гематоксилином и эозином.

Помимо парафиновой заливки, используют заливку в целлоидин и полиэтиленгликоль, при этом применяется другая схема проводки. В желатин заливают кусочки без обезвоживания, сразу после фиксации.

Гистохимия.

Методы гистохимии направлены на выявление тех или иных молекул в клетках и тканях, что позволяет изучать специализированные типы клеток, их изменения в норме и патологии. Существует множество гистохимических методов, многие – очень сложные, многоступенчатые и трудоемкие.

Пример:

Выявление ДНК по Фельгену

Реактивы:

1. Метиловый спирт.

2. 3N раствор HCl.

3. Реактив Шиффа.

4. 1N HCI.

Дата добавления: 2014-01-11