Ускоренные и экспресс-методы определения чувствительности-устойчивости микроорганизмов к антибиотикам

Высокая частота устойчивости возбудителей гнойно-септических заболеваний к антибиотикам и изменение спектра и уровня устойчивости микробных популяций в течение болезни обусловливают необходимость определения их чувствительности перед назначением препарата и в процессе лечения. При использовании классических методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам-метода серийных разведений в жидкой или плотной питательной среде, а также метода бумажных дисков – ответ может быть получен не ранее чем через 18 часов от начала исследования (с учётом времени, необходимого для выделения чистых культур – через 48-72 ч.)

Эффективность химиотерапии повышается при раннем назначении этиотропного лечения, которое можно обеспечить использованием методов и средств быстрого определения чувствительности к антибиотикам возбудителей заболеваний. Проведено ряд исследований, достоверно подтверждающих преимущества ускоренных методов. Так, в исследованиях Barenfanger и Doern c соавт. показано, что сокращение среднего времени исследования от 44,4 до 39,2 ч. сопровождалось сокращением койко-дня с 12,6 до 10,7 суток, снижением средней стоимости лечения пациента с 6677 до 4927 долларов США и летальности – от 9,6% до 7,9%.

Разработанные для этой цели методы могут были разделены на ускоренные, в которых исследуются выделенные чистые культуры возбудителей и экспресс-методы, позволяющие устанавливать антибиотикограмму возбудителей непосредственно в нативном материале или первичном посеве, т.е. без выделения чистых культур.

Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к химиопрепаратам дают возможность получить ответ спустя 2-6 ч. от начала исследования чистых культур. По принципу и механизму реакций, возникающих в результате действия антибиотиков, можно выделить 5 групп ускоренных методов, которые основаны на:

1) выявлении изменений ферментативной активности бактерий;

2) выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды развивающимися микроорганизмами;

3) цитоморфологической оценке изменений бактериальных клеток и формирования микроколоний;

4) определении изменений оптической плотности среды растущей популяцией или включения радиоизотопов в микробные клетки;

5) использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами.

1.Сущность методов 1-й группы заключается в следующем: в мясо-пептонный бульон с глюкозой добавляют антибиотик в необходимой концентрации, а затем засевают испытуемый штамм микробов. Устойчивые к данному антибиотику микроорганизмы усваивают глюкозу, что проявляется изменением кислотно-щелочного потенциала (pH) среды. Для определения изменений pH среды предложено использовать индикаторы, которые изменяют свой цвет при снижении pH – феноловый красный, индикатор Андреде и бромтимоловый синий.

2.Методы 2-й группы, получившие наибольшее распространение, основаны на выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды (rH2) развивающимися микроорганизмами в присутствии антибиотиков с помощью биологических или химических редокс-индикаторов. В связи с этим для определения чувствительности бактерий разных видов возможно использование одних и тех же индикаторов. Микроорганизмы, которые устойчивы к антибиотику, растут и размножаются в среде и снижают rH2 – потенциал, в результате чего индикатор, добавленный к питательной среде, изменяет свой цвет. Чувствительные микроорганизмы в зоне диффузии антибиотиков не размножаются и не изменяют rH2, вследствие этого цвет среды вокруг дисков не изменяется.

В качестве таких индикаторов нашли применение резузарин, суспензии человеческих, кроличьих или бараньих эритроцитов, 2,6-дихлорфенолиндофенол, 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, водные растворы красной кровяной соли и железоаммиачных квасцов, метиленовый синий, водный голубой с розоловой кислотой, молибденовокислый аммоний, соли азотной кислоты.

3.Цитоморфологические ускоренные методы основаны на том принципе, что микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам при 3-4-часовом росте на средах с химиопрепаратами, не увеличивают размеров микробной клетки или не образуют микроколоний на специальных препаратах с питательными средами. Необходимость использования в методах этой группы либо специальных препаратов для установления изменений величины клеток, либо микрокамер, целлофановых пластинок или мембранных фильтров с последующим микроскопическим изучением формирования на них микроколоний в световом, фазово-контрастном или люминесцентном микроскопах делает эти методы трудоемкими и требующими специального технического оснащения.

4.Предложены ускоренные методы, основанные на выявлении динамики оптической плотности культур в присутствии антибиотика с помощью нефелометра или спектрофотометра.

5.Пятая группа ускоренных методов основана на использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами для достижения быстро регистрируемых изменений в среде. В качестве таких стимуляторов используют экстракт бычьего сердца и глюкозу, кровь и глюкозу, индолилмасляную и индолилуксусную кислоты, гибереллин.

М.И. Леви с соавт. предложили экспресс-метод определения чувствительности к антибиотикам возбудителей гнойно-септических инфекций. Для экспресс-анализа использован метод серийных разведений антибиотиков в цветной питательной среде, содержащей 0,002% индикатора бромкрезолпурпурного и 0,5% глюкозы. При росте устойчивых к антибиотикам микроорганизмов снижается рН питательной среды и индикатор изменяет свой цвет, чувствительные к антибиотикам микроорганизмы цвет среды не изменяют. Исследования проводили в пластмассовых планшетах, в луночках которых приготавливали разведения антибиотиков на цветной питательной среде. В контрольные лунки вносили только цветную питательную среду. Гнойное отделяемое из ран больных забирали ватным тампоном, смоченным цветной питательной средой, готовили разведения материала и по 0,05 мл добавляли в луночки планшетов с различными разведениями антибиотиков. Планшеты помещали в термостат до изменения исходного цвета питательной среды в контрольных лунках (без антибиотиков) в желтый (обычно 3-6 часов). Затем учитывали результаты анализа. Сохранение исходного цвета питательной среды в опытной луночке свидетельствовало о чувствительности микрофлоры к данной концентрации антибиотика, появление желтого цвета – об устойчивости микрофлоры к такой концентрации препарата.

Принципиально новый метод экспрессного определения лекарственной устойчивости микроорганизмов разработан на основе использования реакции ДНК-ДНК гибридизации. Принцип метода заключается в применении ДНК-зондов, выявляющих у микробов генетические детерминанты, кодирующие плазмидную или хромосомную резистентность микробной популяции к определенным типам или группам антибиотиков. ДНК-зонды метятся радиоактивной, люминесцентной или ферментной меткой. При использовании ДНК-зондов не требуется выделение чистой культуры микробов или подращивания материала на питательных средах, что значительно сокращает сроки исследования.

Чувствительность реакции ДНК-ДНК гибридизации может быть значительно повышена при предварительном использовании полимеразной цепной реакции, в которой за 30-40 циклов в течение часа из одного ДНК-фрагмента можно получить до 10⁸ ампликонов. После накопления ДНК и ее рестрикции эндонуклеазами генетический анализ фрагментов проводят в реакции ДНК-ДНК гибридизации. Благодаря высокой специфичности и чувствительности совместного применения полимеразной цепной реакции и метода молекулярной гибридизации обеспечивается возможность получения результатов в течение 6-8 часов от начала исследования нативного материала. Однако, необходимость наличия сложного и дорогостоящего оборудования и реактивов ограничивает использование методов молекулярной диагностики в практике.

Дата добавления: 2014-01-11