Лекция 13. Иммунохимический анализ

• Молекулярные основы иммунохимического анализа. Специфичность и чувствительность

иммунохимических (серологических) реакций. Уровни регистрации реакций антиген-антитело

(первичный и вторичный).

• Феномен агглютинации. Прямая и непрямая агглютинация. Эритроциты как один из носителей

антигенов в реакциях непрямой агглютинации.

• Феномен преципитации и основанные на нем реакции. Диффузионный метод преципитации и

иммуноэлектрофорез.

• Реакция связывания комплемента. Компоненты, необходимые для постановки реакции. Характеристика

индикаторной системы для суждения об активности комплемента.

• Нейтрализация и усиление биологических эффектов антигена.

• Принцип реакций, основанных на меченых антителах. Варианты меток. Иммунофлюоресцентный и

иммуноферментный анализы. Иммуноблоттинг.

• Значение иммунохимического анализа в биологии и медицине.

Иммунохимический анализ объединяет методы, основанные на реакциях антиген-антитело. Такие реакции часто называют «серологическими», так как до недавних пор единственным источником антител служила сыворотка (лат. serum) крови иммуннизированных животных. Лишь с внедрением гибридомной технологии антитела стали получать в культурах клеток. Это существенно повысило специфичность анализа, так как каждая гибридома продуцирует антитела против единственного эпитопа.

С помощью иммунохимического анализа решаются две основных задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют известные антитела. Например, выявление поверхностного антигена вируса гепатита В проводят при помощи антител против HВsAg, а наличие анти-HВs антител тестируют в реакциях с HвsAg.

Главным стимулом для совершенствования иммунохимических методов было (и остается) стремление к повышению их чувствительности: она тем выше, чем меньше концентрация выявляемых антител и антигенов. Другим мотивом служило изучение антигенных смесей, нацеленное на расшифровку входящих в их состав компонентов. Сюда примыкает анализ спектра антител, продуцируемых в ходе иммунного ответа, например инфекционного процесса1.

Взаимодействие антиген-антитело исследуют на двух уровнях – первичном и вторичном. В первом случае констатируют лишь сам факт образования иммунного комплекса. Это можно сделать, если антиген или антитело мечены подходящим маркером, например, изотопом. Такие анализы отличаются максимальной чувствительностью. Вторичный уровень характеризуется внешними (видимыми) проявлениями реакции. Они требуют для своего воспроизведения более высокой концентрации ингредиентов (антигенов и антител), т.е. менее чувствительны.

Методы, основанные на вторичных (внешних) проявлениях реакции антиген-

антитело (реакции второго уровня)

Внешние (вторичные) эффекты, на которых базируется иммунохимический анализ, включают (1) агглютинацию, (2) преципитацию, (3) связывание комплемента, (4) нейтрализацию или усиление биологических эффектов антигенов.

Агглютинация (от лат. agglutinare – склеивать). Один из ингредиентов реакции (обычно антиген) находится в корпускулярной форме. Антитела выявляются по их способности агглютинировать антигенные частицы, например, бактерии, эритроциты, латекс и пр.

Антиген может быть собственным компонентом частицы либо искусственно сорбирован на ней. В первом случае говорят о прямой агглютинации, второй вариант называется непрямой, или пассивной агглютинацией. Чувствительность пассивной агглютинации выше, так как плотность антигенных молекул на частицах в этом случае больше, чем на естественных носителях[1]. Одним из распространенных адсорбентов служат эритроциты – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Преципитация (от лат. precipitare – осаждать). Оба ингредиента находятся в растворимой форме. При их взаимодействии (в определенных концентрациях и соотношениях) образуется осадок. Наиболее широко используется двойная (или встречная) иммунодиффузия в геле (агар, агароза). В этом случае антиген и антитело мигрируют навстречу друг другу, и каждая пара образует собственную линию преципитации. Исследуя количество и взаиморасположение линий, можно судить о числе ингредиентов реакции и степени их идентичности (рис. 1-13).

Рис. 1-13. Двойная иммунодиффузия в геле (реакция по Оухтерлони). Анализ фракций сыворотки человека, полученных при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-200. Верхние лунки (слева направо) – фракции с мол. массой 19S, 7S и 4S; нижние лунки – цельная сыворотка; центральные лунки антитела против сыворотки человека (антисыворотка кролика). Пересекающиеся линии преципитации (верхний ряд) означают, что фракции содержат разные антигены. Сливающиеся линии нижнего ряда говорят об идентичности антигенов, внесенных в его лунки (цельная сыворотка).

Разрешающую способность метода можно существенно повысить, если смесь антигенов предварительно (перед встречной иммунодиффузией) подвергнуть электрофорезу. В этом случае антигены распределяются на большем пространстве, что

повышает дискретность линий преципитации. Эта методика известна как иммуноэлектрофорез (рис. 2-13). Несмотря на низкую чувствительность иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез незаменимы для решения специальных задач.

Связывание комплемента. Реакция основана на том, что комплексы антиген-антитело (IgM и IgG), активируя (связывая) комплемент, снижают его содержание в сыворотке (см. лекция 10). Это происходит даже тогда, когда иммунные комплексы не обнаруживаются визуально, т.е. не образуют агглютинатов или преципитатов. Поэтому РСК отличается высокой чувствительностью.

О потреблении (связывании) комплемента судят по индикаторной системе, которая выявляет цитолитическую активность комплемента. Такой системой служат эритроциты

Рис. 2-13. Иммуноэлектрофорез (классический вариант). Иммуноэлектрофореграммы двух сывороток человека. В лунки геля были внесены сыворотки и проведен электрофорез. Затем в центральную траншею были добавлены антитела против сыворотки человека и проведена реакция встречной иммунодиффузии. По числу линий, каждая из которых соответствует одной паре антиген-антитело, можно судить о количестве компонентов (антигенов) в исследуемом препарате.

барана, покрытые (сенсибилизированные) антиэритроцитарными антителами1, и сыворотка морской свинки (комплемент). Фиксируя комплемент, сенсибилизированные эритроциты (т.е. комплекс антиген-антитело) подвергаются гемолизу. Напротив, если их добавляют в среду, где произошла реакция антиген-антитело, гемолиз отсутствует, так как комплемент истощается «чужими» иммунными комплексами. На этом основании судят о присутствии антител (добавление известного антигена) или антигена (добавление известных антител).

Нейтрализация биологических эффектов антигена. Если антиген обладает биологической активностью, антитела можно выявить по ее подавлению. К такого рода реакциям относится нейтрализация бактериальных токсинов, иммобилизация бактерий, инактивация вирусов и бактериофагов. В диагностической иммунологии широко используется реакция торможения вирусной гемагглютинации. Она основана на способности антител блокировать агглютинацию эритроцитов антигенами (гемагглютининами) вирусов.

Усиление биологических эффектов антигена. Можно привести два примера, когда антитела усиливают (точнее проявляют) биологическую активность антигенов или их носителей. Внутрикожная апликация IgE-антител, содержащихся в сыворотке больных атопическими заболеваниями, предрасполагает к местной аллергической реакции на введение (в то же место) специфического антигена (диагностический тест Прауснитца-Кюстнера). Другой пример – опсонический эффект антител в реакциях с фагоцитами. Здесь антитела после связывания с объектом фагоцитоза (например, бактериями) напрямую или опосредованно (через комплемент) активируют фагоциты (см. лекция 8).

Методы, основанные на меченых антителах (реакции первого уровня)

К этой группе относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализы. Они обладают наиболее высокой чувствительностью, так как не зависят от внешних (вторичных) эффектов, связанных с образованием иммунных комплексов.

Иммунофлюоресцентный (иммунолюминесцентный) анализ. Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, конъюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи специального (люминесцентного) микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин. Поглощая ультрафиолет с длиной волны 290-495 нм, он испускает видимый свет (флюоресцирует) в зеленой части спектра (525 нм). При помощи иммунофлюоресцентного метода была впервые установлена природа клеток, синтезирующих антитела, определена локализация иммунных комплексов при аутоиммунной патологии, разработаны новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний.

Метод используется в двух основных вариантах – прямом и непрямом. В первом случае антитела, конъюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированными на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение, обнаруживаемое под люминесцентным микроскопом (рис. 3-13).

Рис. 3-13. Иммунофлюоресцентный анализ (прямой метод). Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с антителами против искомого антигена, конъгированными с флюоресцеином. После отмывания препарат микроскопируют в ультрафиолете, отмечая флюоресценцию в зонах связывания меченых антител (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4^th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

.

Непрямой, или сэндвич-метод может быть использован для определения как антигенов, так и антител. Реакцию проводят в два этапа (рис. 4-13). Сначала антигены, фиксированные на предметном стекле, обрабатывают немечеными антителами. После отмывания связавшиеся с антигеном антитела выявляют при помощи антииммуноглобулиновых антител, меченых флюоресцеином. Это дает возможность пользоваться унифицированным реагентом (меченые антиантитела) для выявления антител к разным антигенам.

Рис. 4-13. Иммунофлюоресцентный анализ (непрямой метод). Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с немечеными антителами против искомого антигена. После отмывания препарат обрабатывают флюоресцеин-мечеными антителами против антител, использованных на первом этапе (например, козьи антитела против иммуноглобулинов кролика). Отмывают и анализируют под люминесцентным микроскопом (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4^th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

.

Радиоиммунный анализ. Меткой служат изотопы, обычно радиоактивный йод. Одним из распространенных вариантов является количественное определение антигенов по конкурентному связыванию с антителами. Принцип основан на ослаблении реакции между антителами и меченым антигеном в присутствии того же, но немеченого антигена. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем больше антител будет им заблокировано и тем меньше антител останется для связывания меченого антигена, вносимого в ту же систему. Измеряя радиоактивность иммунных комплексов, можно судить о содержании антигена в исследуемом материале.

Для отделения иммунных комплексов от непрореагировавших ингредиентов предложены разные способы. Самый популярный основан на принципе твердофазных сорбентов. В этом случае антитела фиксируются на инертных частицах, которые легко осаждаются при центрифугировании. Вместе с ними будут оседать и связанные (в том числе меченые) антигены.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Неудобство работы с радиоактивными изотопами побудило к разработке реакций, основанных на антителах и антигенах, конъюгированных с ферментами, чаще с пероксидазой (ее получают из хрена). Присутствие энзиммеченых молекул можно обнаружить визуально или спектрофотометрически по изменению цвета хромогенного субстрата, чувствительному к данному ферменту1. Реакция отличается высокой чувствительностью, так как для ее выявления достаточно ничтожной концентрации фермента (10^-15 моль/л и ниже).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА2. Он основан на том, что один из ингредиентов (антиген или антитело) фиксируется на инертном носителе (обычно полистироле), выполняя роль иммуносорбента. Существуют разные модификации метода. В их основе лежат принципы, о которых уже говорилось в связи с иммунофлюоресцентным и радиоиммунным анализами. На рис. 5-13 и 6-13 прокомментированы два варианта ИФА, широко используемые в диагностике инфекционных заболеваний.

Рис. 5-13. Определение антител в ИФА (непрямой метод). Антигены сорбируют на инертном носителе (лунки полистиролового микропланшета). На первом этапе в лунки добавляют исследуемую сыворотку. Антитела (Ат₁) связываются с антигенами. После отмывания в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов человека («античеловеческий иммуноглобу-

лин»), конъгированные с ферментом (второй этап). После отмывания добавляют хромогенный субстрат (например, смесь о-фенилендиамина и перекиси водорода при метке пероксидазой) и каждую лунку спектрофотометрируют относительно негативного (сыворотка без антител) и позитивного (сыворотка с искомыми антителами) контролей (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4^th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Рис. 6-13. Определение антигенов в ИФА (принцип «ловушки»). Исследуемый материал (антиген)) вносят в лунки полистиролового микропланшета, где предварительно фиксируют антитела против искомого антигена (первый этап). Антигены связываются с антителами, закрепляясь на сорбенте. После отмывания в лунки добавляют энзиммеченые антитела (Ат-энзим) против того же антигена (второй этап). Они фиксируются на сорбенте за счет связывания со свободными эпитопами антигена. После отмывания определяют активность фермента, закрепившегося на сорбенте (третий этап). Ее величина будет пропорциональна концентрации антигена в исследуемом материале (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4^th ed. J.B. Lippincott Company. 1992). На втором этапе можно использовать немеченые антитела. Об их связывании с антигеном судят при помощи энзиммеченых антител против имуноглобулинов человека (см. рис. 5-13). Это позволяет унифицировать энзиммеченый реагент, хотя и усложняет реакцию (многослойный сэндвич).

Иммуноблоттинг («Western Blot”). На основе ИФА разработан один из самых специфичных и чувствительных методов иммунохимического анализа – иммуноблоттинг (от англ. blot – промокать, пятно). Он сочетает ИФА с электрофорезом и предназначен для изучения спектра антител к антигенным смесям. Кроме решения научных задач, это имеет важное значение в диагностике некоторых инфекций (таких как гепатит С и СПИД) для исключения ложноположительных результатов «обычного» ИФА (они изредка возникают за счет перекрестно реагирующих («неспецифических») антител).

Рис. 7-13. Иммуноблоттинг. Определение спектра анти-ВИЧ антител. Этап 1: Вирусные антигены (белки (p), гликопротеины (gp)) подвергаются электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Это ведет к разделению антигенов на фракции по молекулярной массе (мол. масса в кДа отмечена цифрами). Этап 2: Фракции антигена переносят при помощи электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на полоски (стрипы). Этап 3: Стрипы инкубируют с исследуемой сывороткой и затем отмывают от несвязавшегося материала. Этап 4: Стрипы инкубируют с энзиммечеными антителами против иммуноглобулинов человека, отмывают. Этап 5: Добавляют хромогенный субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен). Они совпадают с зоной локализации антигенов, которые прореагировали с антителами исследуемой сыворотки. В данном случае сыворотка содержит антитела против gp41, p24 и р31. Это доказывает диагноз ВИЧ-инфекции (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4^th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Принцип метода (на примере выявления антител к вирусу иммунодефицита человека) показан на рис. 7-13. Смесь антигенов, экстрагированных из исследуемого объекта (в данном случае ВИЧ), разделяют на фракции при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и, используя электрофорез, воспроизводят на ней точную копию белковых фракций, полученных в полиакриламидном блоке1. На заключительном этапе полоски (стрипы) нитроцеллюлозы анализируют в реакции ИФА с исследуемой сывороткой. Количество выявленных фракций (пятен) отражает спектр антител к антигенам анализируемой смеси. Наличие антител к двум и более антигенам предполагаемого возбудителя не может быть случайным, подтверждая диагноз заболевания.

В последние годы разрабатываются методы, позволяющие одновременно дифференцировать множество (несколько тысяч) антигенов. Они основаны на использовании наборов (библиотек) рекомбинантных антител, принципиально новых микросорбентов (чипсов, англ. chips) и методов ультраточечной регистрации реакций (лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия, плазмоновый резонанс и др.). Это открывает новые перспективы для функциональной генетики (расшифровка протеома, т.е. всех белков, закодированных в геноме клеток), сравнительного картирования белков нормальных и патологических (в частности, раковых) клеток, изучения фармакологических воздействий и пр.

Тесты для самоконтроля

1. Обязательные ингредиенты иммунохимических (серологических) реакций:

1. Антигены. 2. Комплемент. 3. Цитокины. 4. Антитела. 5. MHC(HLA).

(1,4)

2. Иммунохимические реакции 1-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

(5)

3. Иммунохимические реакции 2-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

(1,2,3,4,6)

4. Методы иммунохимического анализа, основанные на феномене преципитации:

1. Реакция двойной иммунодиффузии в геле. 2. Реакция непрямой гемагглютинации.

3. Иммуноэлектрофорез. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Иммуноблоттинг.

(1,3)

Дата добавления: 2014-01-14