Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани

В животных тканях

Исследование процессов биологического окисления

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

(биоэнергетика)

Существует два основных типа энергетики живых организмов – фототрофный и хемотрофный. Первым обладают растения и фотосинтезирующие микроорганизмы, которые преобразуют энергию солнечного света в энергию фосфатных связей АТФ, а вторым – клетки организмов, в том числе человека и животных, использующие для образования АТФ энергию окислительно-восстановительных реакций.

Основная часть энергии в тканях человека и животных образуется аэробным путем в ходе окислительного фосфорилирования в митохондриях. Анаэробное образование энергии происходит в процессе гликолиза (гликогенолиза). Однако он играет вспомогательную роль.

Упрощенно аэробное образование энергии можно представить следующей схемой:

Эффективность этого процесса зависит от активности дегидрогеназного звена (т.е. от наличия субстратов окисления S·H₂ и активности дегидрогеназ), которое обеспечивает поступление водорода, связанного с НАД или ФАД, на дыхательную цепь митохондрий, а также от сопряжения дыхания и фосфорилирования (см. учебник с.204-214).

Цитохромоксидаза, или комплекс цитохромов а + а₃, является заключительным компонентом дыхательной цепи митохондрий животных и растительных клеток. Этот фермент переносит электроны на кислород. Он прочно связан с внутренней мембраной митохондрий и извлекается только при ее разрушении. Цитохромоксидаза может окислять ряд синтетических субстратов, например, α-нафтол и N,N΄-диметил-n-фенилендиамин (реактив НАДИ, названный по первым слогам обоих соединений). Реактив НАДИ используется для обнаружения этого фермента в тканях.

Реактивы. Реактив «НАДИ»^*.

Оборудование. Ступка с пестиком; воронка для фильтрования; фильтровальная бумага; ножницы; стеклянные палочки; марля или бинт; пипетки вместимостью 1 мл; мерный цилиндр; водяная баня; аптечные весы с разновесами.

Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного.

Метод основан на образовании в ходе реакции окисления диметил-n-фенилендиамина и α-нафтола цитохромоксидазой индофенолового голубого, интенсивность синей окраски которого пропорциональна активности фермента:

Ход определения. 5 г мышечной ткани измельчают ножницами и тщательно растирают в ступке, добавляя порциями 20 мл дистиллированной воды. Мышечную кашицу фильтруют через двойной слой марли и многократно промывают дистиллированной водой до бесцветной окраски промывных вод.

Бесцветную массу, которая содержит цитохромоксидазу, комплекс цитохромов и некоторые дегидрогеназы, отжимают между листами фильтровальной бумаги. Полученный остаток кашицы делят на три части: одну переносят в пробирку, а две другие оставляют на фильтровальной бумаге.

К кашице в пробирке приливают 1 мл дистиллированной воды и кипятят содержимое на водяной бане 1 мин. Пробирку охлаждают, осторожно сливают жидкость и мышечную кашицу с помощью стеклянной палочки переносят на другой лист фильтровальной бумаги.

На первую порцию мышечной кашицы (кипяченую) и вторую (некипяченую) наносят по 2-3 капли реактива НАДИ, третью (тоже некипяченую) – сначала смачивают раствором азида натрия, а через 3 мин на нее наносят 2-3 капли реактива НАДИ. Сравнивают характерные окраски проб.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

№ пробы	Материал	Фермент	Субстраты	Условия опыта	Окраска пробы
температурная обработка	ингибиторы

Практическое значение работы. Цитохромоксидаза как гемсодержащий белок очень чувствительна к действию цианидов, сульфидов, азидов и прочих веществ, взаимодействующих с железом гема. При отравлении этими соединениями происходит угнетение цитохромоксидазы и развивается гистотоксическая гипоксия, т.е. кислородное голодание тканей, связанное с невозможностью использовать кислород как акцептор электронов и протонов в дыхательной цепи митохондрий. Метод выявления цитохромоксидазы реактивом НАДИ используется в клинике и цитологии для выявления этого фермента в биоптатах и мазках клеток крови с целью диагностики нарушений тканевого дыхания.

Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования

и действия на него разобщителей

Для исследования окислительного фосфорилирования определяют величину поглощения кислорода в тканях и одновременно убыль добавленного в среду неорганического фосфата. Это позволяет вычислить коэффициент фосфорилирования – Р/О. Потребление кислорода тканями при окислении субстратов не является достоверным показателем интенсивности окислительного фосфорилирования, поскольку кислород расходуется и в других, немитохондриальных, реакциях. Кроме того, активная утилизация его еще не означает аналогичного по интенсивности фосфорилирования, т.е. эти два процесса могут быть в той или иной степени разобщены. Использование неорганического фосфата в реакции этерификации: Ф_н+АДФ→АТФ происходит не только в ходе окислительного фосфорилирования, но и в гликолизе. При отсутствии в среде субстратов гликолиза или при ингибировании его и при создании необходимых условий для функции дыхательной цепи митохондрий можно считать, что почти весь Ф_н расходуется в ходе окислительного фосфорилирования и его убыль является индикатором этого процесса.

Реактивы. Хлорид калия, 0,15 М раствор; К-фосфатный буфер (рН 7,4), приготовленный из KH₂PO₄ (содержание неорганического фосфора 0.1 моль/л); малат натрия, 0,16 М раствор; хлорид магния, 0,6 М раствор; фторид натрия, 5,7 М раствор; АДФ, динатриевая соль, 9,1∙10^-2 М раствор; сукцинат натрия, 0,3 М раствор; 2,4-динитрофенол, 0,01 М раствор; азид натрия, 1 М раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты.

Оборудование. Штатив с пробирками; гомогенизатор с пестиком из тефлона; моторчик для гомогенизации; пипетки вместимостью 1 мл; бюретка вместимостью 25 мл; стеклянные палочки; воронка со складчатым бумажным фильтром; водяная баня с лабораторным термометром или баня аппарата Варбурга; часы; ФЭК.

Материал. Печень белой крысы.

Метод основан на измерении расхода добавленного неорганического фосфата Ф_н в ходе реакции окислительного фосфорилирования в митохондриях, содержащихся в гомогенатах печени. Использование Ф_н в гликолизе блокируется содержащимся в среде инкубации фторидом натрия.

О действии разобщителя (2,4-динитрофенол) и ингибитора (азид натрия) окислительного фосфорилирования также судят по убыли неорганического фосфата в присутствии малата как субстрата окисления.

Неорганический фосфат утилизируется по схеме

H₃PO₄ + АДФ → АТФ + H₂O

Определение содержания Ф_н до и после инкубации основано на реакции, приведенной в работе 11.

Ход определения. Животное забивают, извлекают печень и погружают ее в чашку Петри с раствором хлорида калия, стоящую на льду или на снегу. Тщательно промывают печень от крови средой выделения и промокают фильтровальной бумагой.

Навеску около 2 г отмытой ткани печени переносят на часовое стекло или в чашку Петри, стоящую на льду, и мелко измельчают ножницами. Измельченную ткань помещают в стакан гомогенизатора, куда предварительно налито 18 мл охлажденного раствора хлорида калия. Стакан гомогенизатора помещают в лед или снег, находящийся в мешочке.

Ткань гомогенизируют в течение 40-50 с при вращении пестика 800-1200 об/мин, делая 40-50 движений стаканчика вверх-вниз.

В пять пробирок наливают по 1 мл инкубационной смеси следующего состава:

Компоненты	Состав смеси (в мл) в пробирках
К-фосфатный буфер (рН 7,4)	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
Малат натрия	0,1	-	-	0,1	0,1
Сукцинат натрия	-	0,1	-	-	-
Хлорид магния	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Фторид натрия	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
АДФ∙Na2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Дистиллированная вода	0,3	0,3	0,4	0,2	0,2
2,4-Динитрофенол	-	-	-	0,1	-
Азид натрия	-	-	-	-	0,1

Вносят во все пробы по 2 мл полученного гомогената печени, перемешивают стеклянной палочкой и помещают в штатив водяной бани при 37˚С, снабженной устройством для встряхивания пробирок. Отмечают время начала инкубации.

Через 30 мин инкубации реакции во всех пробах останавливают, добавляя к каждой по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое их перемешивают и фильтруют в другие пробирки через складчатый бумажный фильтр.

Из каждой пробы отбирают по 1 мл безбелкового фильтрата в чистые пробирки и приливают к ним по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой, затем из бюретки добавляют по 7 мл дистиллированной воды и вновь перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания.

Перед фотометрией готовят стандартную пробу, для чего в пробирку вносят 0,1 мл фосфатного буфера, 0,9 мл трихлоруксусной кислоты, 1 мл реактива молибдата аммония и 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое перемешивают, затем добавляют из бюретки 7 мл дистиллированной воды и опять перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания.

Фотометрируют опытную и стандартную пробы против контрольной (1 мл трихлоруксусной кислоты и 9 мл дистиллированной воды) на ФЭКе при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание неорганического фосфора х (в мкмоль) в пробах рассчитывают по формуле

Е_оп∙10

х = —————,

Е_ст

где Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы;

10 – количество неорганического фосфора в стандартной пробе, мкмоль.

Убыль Ф_н рассчитывают по разнице между количеством его в стандартной и соответствующей опытной пробах.

Оформление работы. Полученные данные внести в таблицу.

№ пробы

Субстрат окисления

Разобщители и ингибиторы

Содержание Фн в пробе, мкмоль

Убыль Фн, мкмоль

В выводе указать возможность протекания окислительного фосфорилирования без субстрата окисления и особенность действия на него разобщителей и ингибиторов; отметить практическое значение обнаруженных феноменов.

Практическое значение работы. Клетки и ткани организма человека отличаются друг от друга скоростью дыхания и связанного с ним фосфорилированием. Наиболее активное окислительное фосфорилирование отмечается в тканях, богатых митохондриями, например, в почках, сетчатке глаза, корковом веществе головного мозга, сердце, печени; менее развит этот процесс в скелетных мышцах, коже, а в эритроцитах человека он вообще отсутствует. В клинико-биохимических исследованиях используются методы определения окислительного фосфорилирования в лейкоцитах крови и биоптатах для оценки энергетического обмена при различных патологических состояниях, а также для изучения действия лекарств и ядов, которые могут проявлять свойства разобщителей или ингибиторов.

Дата добавления: 2014-11-06