Послідовність операцій по виділенню білків

Методи виділення й очистки білків.

Так як білкові речовини сировини (борошна, крупи, молока, м'яса), включаючи ферменти, часто є визначальними у забезпеченні якості харчових виробів, то для того, щоб дослідити фізико-хімічні, біологічні та фізіологічні властивості цих білків, а також для вивчення їх хімічного складу та структури, треба виділити білки у гомогеному стані.

Особливість білків: слід пам’ятати, що білки дуже чутливі до збільшення температури та дії багатьох хімічних реагентів (органічні розчинники, луги, кислоти). Тому звичайні методи органічної хімії тут не підходять.

Отже – одержувати білки можна тільки за умов низької температури (не більше+4°С) та з використанням реагентів, які не руйнують структуру білків.

І. Гомогенізація. Подрібнення біологічного матеріалу:

– ножові та пестикові гомогенізатори;

– метод поперемінного заморожування та відтаювання;

– ультразвук та інші.

ІІ. Екстракція. Переведення білків у розчинний стан

Як правило гомогенізація супроводжується екстракцією білків. Для цього використовують:

– розчини солей – більшість білків добре розчиняються в 8 – 10% розчинах солей;

– буферні розчини з визначеними значеннями рН – часто використовують фосфатні, боратні, цитратні;

– органічні розчинники – водні розчини гліцерину, розчини сахарози, етанол, ацетон (майже всі органічні розчинники розривають білок-ліпідні зв’язки);

– деякі детергенти (ПАВ) – порушують гідрофобні взаємодії поміж білками та ліпідами, а також поміж білковими молекулами. Зокрема, для екстракції білків із біологічних мембран використовують тритон Х-100, додецилсулфат натрію та дозексіхолат натрію.

ІІІ. Фракціонування та очистка білків – білки перевели в розчин, тепер їх треба розділити:

– Розчинення білків у воді зумовлене гідратацією кожної молекули, тобто утворенню навколо молекули водних (гідратних) оболонок. Такі розчини вкрай нестабільні.

а) Висолювання – порушення гідратної оболонки навколо молекул білка під дією солей лужних та лужноземельних металів, що призводить до випадіння білків в осад.

Як правило після видалення солі білок не втрачає здатності розчинятися у воді. Різні білки випадають в осад при різних концентраціях нейтральних розчинів сульфату амонію. На величину висолювання білків впливає не тільки природа солі, але й рН розчину і температура;

б) Теплова денатурація.

в) Осадження органічними розчинниками.

г) Хроматографія. Принцип методу – здатність речовин специфічно адсорбуватися на сорбенті.

д) Гель хроматографія або гель фільтрація – метод молекулярних сит. У препаративних цілях, коли треба позбутися домішок. Використовують сефадекс. У воді його зерна сильно розбухають, утворюючи гель. Колонка. Принцип розділення – великі молекули не проникають у внутрішню водну фазу, яка є стаціонарною, і рухаються разом із рухомою фазою. Вони першими вийдуть із колони. Маленькі молекули легко входять у зерна, утворюючи рівноважну систему між рухомою та нерухомою фазами, отже – з меншою швидкістю рухаються до дна колонки. Можна розділити білки з різною молекулярною масою

В процесі гельфільтрації білкова суміш пропускається крізь пористі сфери сорбента, що забезпечує її розділення за молекулярною масою.

Найбільш часто використовують колонки для гельфільтрації – Superose, Sephadex і Sephacry l. Першими з колонки сходять важкі білки, за ними слідують середні та легкі. Найлегші білки та домішки знімаються з колонки в останню чергу. Гельфільтрація забезпечує значну очистку білка, також дозволяє відділити його можливі агрегати від основної, гомогенної фракції.

е) Електрофорез – в основі методу лежить різниця в швидкості руху білків в електричному полі, що визначається величиною заряду самого білка за певних значень рН та йонної сили розчину. Один із найпоширеніших – диск-електрофорез у поліакриламідному гелі (від англ. discontinuous – переривистий). Велика роздільна здатність (разрешающая способность). Приклад: білки сироватки крові, папір – 6 фракцій, ПААГ ЕФ – до 18 фракцій. На електрофореграмі білки виявляють за допомогою барвників.

Дата добавления: 2014-10-22