Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Окрашивание гликогена методом реактив Шиффа—йодная кислота. (ШИК-реакция) в модификации A. JI. Шабадаша




Выявление нуклеиновых кислот с использованием галлоцианина и хромовых квасцов по Эйнарсону.

При больших значениях pH галлоцианином и хромовыми квасцами окрашиваются все базофильные структуры. Специфически нуклеиновые кислоты окрашиваются при pH 0,8—1,75. Метод выявляет одновременно ДНК и РНК. Если необходимо выявить только ДНК или только РНК, срез предварительно обрабатывают рибонуклеазой (как указано выше) или дезоксирибонуклеазой. Последнюю растворяют в фосфатном буфере pH 6,5—7,0 в концентрации 0,2 мг/мл и в качестве активатора добавляют хлорид магния в концентрации 0,2 М. Обработку производят при температуре 37° С в течение 4-—6 ч.

К фиксации особых требований нет, но не следует употреблять фиксаторы, содержащие ртуть или бихромат.

Приготовление раствора: 5 г хромовых квасцов (K2S04Cr2 [S04]3-24 Н2O) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,15 г галлоцианина; раствор кипятят в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и фильтрат доводят дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный раствор имеет pH 1,64 и, следовательно, вполне подходит для выявления нуклеиновых кислот. Раствор пригоден в течение длительного времени.

Методика проведения реакции: 1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят в раствор галлоцианина и хромовых квасцов и окрашивают в течение 48 ч при комнатной температуре; 2) промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой; 3) обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат реакции: нуклеиновые кислоты окрашиваются в серовато-синий цвет.

Выявление альфа-аминокислот нингидриновой реакцией по Ясума и Ичикава используется как общая реакция на белки.

Пригоден материал, фиксированный любым способом. Необходимые растворы: 0,5% раствор нингидрина в абсолютном спирте или 1% раствор аллоксана.

Методика проведения реакции: 1)депарафинированные срезы переносят из дистиллированной воды в раствор нингидрина или аллоксана и выдерживают 16—24 ч при температуре 37° С; 2) промывают водопроводной водой в течение нескольких минут; 3) проводят обработку реактивом Шиффа в течение 15—30 мин; 4) промывают в водопроводной воде 10 мин; 5) обезвоживают в спиртах, заключают в ксилол, бальзам.

Результат: белки окрашиваются в цвета от розового до красно-фиолетового.

 

Метод основан на окислении полисахаридов перйодатом калия или натрия с образованием альдегидных групп, дающих реакцию с фуксинсернистой кислотой. В качестве фиксаторов можно рекомендовать насыщенный раствор пикриновой кислоты в абсолютном спирте, жидкость Карнуа, спирт-формол (на 9 частей абсолютного спирта 1 часть формалина) или фиксатор Шабадаша (спирт 96% 100 мл, нитрат меди 1,8 г, нитрат кальция 0,9 г, формалин 10 мл). Кусочки материала должны быть тонкими (2—3 мм толщиной). Как до, так и после фиксации следует избегать контактов кусочков с водой, так как она растворяет гликоген. Материал можно залить в парафин и перед окрашиванием целлоидинировать. Для этого наклеенные на предметное стекло парафиновые срезы обрабатывают ксилолом и 96% спиртом, затем переносят на 1—2 мин в спирт-эфир и далее на 1—2 мин в 2% раствор целлоидина. Вынимают стекла из целлоидина и дают ему стечь. Ждут, пока не образуется тонкая пленка (15—30 с), и переносят препараты на несколько минут в 70—80% спирт для уплотнения целлоидина. Целлоидинирование защищает гликоген от растворения.

Методика окрашивания целлоидинированных срезов: 1) срезы ополаскивают в дистиллированной воде; 2) помещают в 0,23% раствор перйодата калия или в 0,27% раствор перйодата натрия на 15—25 мин (в темноте). Раствор перйодата готовят перед употреблением, используют 1 раз; 3) промывают в 2 порциях дистиллированной воды по 3—4 мин в каждой; 4) обрабатывают в сернистой воде 2 мин; 5) переносят в реактив Шиффа на 20—25 мин (в темноте); 6) обрабатывают в 3 порциях сернистой воды по 3—4 мин в каждой; 7) промывают в повторно сменяемой дистиллированной воде (10—15 мин); 8) докрашивают (по желанию) гематоксилином; 9) промывают водопроводной водой, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат: гликоген и другие углеводные компоненты окрашиваются в красный цвет. Исчезновение окраски после переваривания гликогена альфа-амилазой (0,5% раствор в дистиллированной воде), забуференной 4 мл ацетата до pH 5,5—6,0 30 мин — 1ч при 37° С, свидетельствует о том, что окрашенный продукт был гликогеном.

 




Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-11-25; Просмотров: 1820; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.011 сек.