Выявление АТФазы по методу Вахштейна—Мейзеля

Метод выявления дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинат-дегидрогеназы).

Окрашивание липидов Суданом III.

Используют замороженные срезы материала, фиксированного в формалине или нефиксированного. Заливка в парафин или целлоидин невозможна, так как при использовании этих методов уплотнения жиры экстрагируются.

Приготовление раствора. В 100 мл горячего 70% спирта растворяют 2—3 г Судана III, охлаждают и фильтруют.

Методика окрашивания: 1) срезы из дистиллированной воды переносят в 50% спирт; 2) помещают в раствор судана III на 20—30 мин в закрытом сосуде; 3) ополаскивают в 50% спирте; 4) ополаскивают в дистиллированной воде; 5) окрашивают ядра гематоксилином (без последующей дифференцировки); 6) промывают в водопроводной воде 10—20 мин; 7) заключают в глицерин-желатину.

Результат: жир окрашивается в оранжевый цвет, ядра синие.

Из свежевзятого материала приготовляют криостатные срезы нефиксированной ткани. Срезы либо прямо переносят в инкубационную среду, либо наклеивают на предметное стекло и реакцию проводят на стекле.

Приготовление инкубационной среды: соединяют 0,1 мл 0,1 М раствора NaH₂P0₄, 0,4 мл 0,1 М раствора Na₂HP0₄, 2,5 мл 1,69% NaCl, 0,1 мл 1,15% раствора КС1,0,05 мл 1,22% раствора СаС12,1 мл 1% раствора неотетразолия и 1,4 мл 0,1 М (1,64%) раствора сукцината натрия (янтарнокислого натрия). К раствору сукцината натрия предварительно прибавляют NaOH, доводя pH до 7,5—7,8.

Методика проведения реакции: 1) замороженные срезы переносят в инкубационную среду и выдерживают в термостате при 37 ° С 20—120 мин; 2) ополаскивают дистиллированной водой; 3) фиксируют в 4% нейтральном формалине в течение 30 мин; 4) ополаскивают дистиллированной водой; 5) заключают в глицерин-желатину.

Результат реакции: при высокой активности сукцинатдегидрогеназы продукт реакции окрашен в сине-фиолетовый цвет, при меньшей активности — в красновато-фиолетовый.

Применяют замороженные срезы нефиксированной или фиксированной в холодном ацетоне ткани.

Инкубационная среда. Растворить 25 мг двунатриевой соли АТФ в 20 мл дистиллированной воды, добавить 20 мл 0,2 М трис-буфера (pH 7,2), 1—3 мл 2% раствора нитрата свинца [Pb(N0₃)₂], 5 мл 0,1 М раствора сульфата магния (MgS0₄) и долить 2 мл дистиллированной воды. Если нужно, отфильтровать, довести pH до 7,2 (инкубационную среду готовить перед употреблением и добавлять ингредиенты в указанном порядке).

Методика проведения реакции: 1) помещают приготовленные срезы в инкубационную среду на 10—60 мин при 37° С; 2) тщательно промывают в нескольких порциях дистиллированной воды; 3) обрабатывают раствором желтого сульфида аммония в разведении 1:50 в течение 2 мин (появляется темно-коричневая окраска среза); 4) быстро ополаскивают в дистиллированной воде; 5) заключают в глицерин-желатину или после обезвоживания в бальзам.

Результат: места АТФазной активности окрашены в коричнево-черный цвет.

Дата добавления: 2014-11-25