Дослід 1. Кількісне визначення активності амілази сечі (діастази) за методом Вольгемута

Практична робота

Теоретичні питання

Тема № 3. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

Мета заняття: На прикладі пептидаз панкреатину і амілази слини показати каталітичну роль ферментів у хімічних перетвореннях. Засвоїти методику визначення активності пептидаз і амілази сечі та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Актуальність теми: Знання механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу лежить в основі розуміння метаболічних процесів у клітинах, тканинах та органах організму, що важливо для засвоєння перебігу хімічних перетворень і застосування ферментних препаратів, їх інгібіторів у практичній медицині.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що перебігають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Пояснювати основні положення кінетики ферментативного каталізу.

Ø Розуміти основні ефекти дії ферментів.

Ø Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

Ø Аналізувати механізм дії ферментів на прикладі хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

· за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;

· за кількістю субстрату, що використовується;

· за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД);

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

· залежність швидкості реакції від концентрації субстрату (пояснити і зобразити графічно);

· залежність швидкості реакції від концентрації ферменту (пояснити і зобразити графічно);

· утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;

· рівняння Міхаеліса-Ментен;

· смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).

· вираз ферментативної реакції в подвійних зворотних величинах; рівняння Лануівера-Берка.

4. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

· ефекти зближення та орієнтації;

· ефекти кислотно-основного каталізу;

· ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

5. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості мл 0,1 %-го розчину крохмалю, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл нерозведеної сечі при температурі 45^оС протягом 15 хв.

Матеріальне забезпечення: сеча, 0,1 % р-н крохмалю, 0,1 % розчин I₂ в 0,2 % розчині KI, 0,85 % р-н NaCl, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл 0,85 % р-н NaCl. У першу пробірку додають 1 мл сечі. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – в третю, таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менше, ніж у попередній. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Потім в усі пробірки додають ще по 1 мл 0,85% р-н NaCl та по 2 мл 0,1%-го розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 45°С на 15 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1%-ний розчин йоду в 0,2 %-му розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Показник	№ пробірки
Розведення сечі (в кількість разів)
Кількість 0,1 %-го розчину крохмалю, мл
Забарвлення після додавання йоду	Ж	?	?	?	?	?	?	?	С
Остання пробірка з розчином жовтого кольору

Приклад розрахунку активності амілази в сечі: остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в ній сеча розведена у 16 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 мл сечі розщеплює 2 мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1мл сечі розщеплює - Х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки X = ^{1 × 2_} = ^{2 × 16} = 32 мл

^{1/16 1}

отже: Х (амілазна активність) = 32 умовних одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності в крові та сечі. У нормі активність амілази сечі коливається в межах 16-64 одиниць. При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо протягом першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми.

Дата добавления: 2014-11-25