Перенос на мембрану

Гель-электрофорез

Белки разделяются при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Разделение белков можно производить по изоэлектрической точке (pI), молекулярной массе, электрическому заряду или по сочетанию этих параметров.

Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей. Денатурированные полипептиды мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее и, таким образом, разделяются в соответствии с молекулярной массой.

Образцы на гель наносят в карманы. Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы (смеси белков с известными массами). После подачи напряжения белки двигаются в электрическом поле с различной скоростью. Отличия в скорости продвижения — электрофоретической подвижности приводит к разделению белков на полосы.

Рис.1. Электрофорез в полиакриламидном геле.

Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторид. Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Другой метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (от. Англ. blotting) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки.

Дата добавления: 2014-11-25