Выделение вирусов на куриных эмбрионах

Выделение вирусов на лабораторных животных.

Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса. Лабораторные животные являются биологической моделью. Иногда приходится проводить 3-5 «слепых», безсимптомных пассажей, прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако, к некоторым вирусам лабораторные животные не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных. Как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.

Цель заражения лабораторных животных:

1. Изучить патогенез болезни;

2. Выделить вирус из пат.материала;

3. Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;

4. Наработка вакцин;

5. Поддержание вирусов в условиях лаборатории;

6. Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;

7. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают в мозг; респираторных интранозально, интратрахеально; дерматропных - подкожно и внутрикожно.

Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:

- Подкожный; - Интрацеребральный; - Внутрикожный;

- Интраперитониальный; - Внутримышечный; - Интраокулярный;

- Внутривеннвй; - Интранозальный; - Алиментарный;

После заражения животных метят, помещают их в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается.

3 признака указывают на результативность заражения:

- наличие клинических признаков

- гибель животного

- патологоанатомические изменения (величины, формы, цвета и консистенции органа).

Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Преимущества:

1. Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;

2. У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;

3. Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;

Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.

Условия:

1. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;

2. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;

3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;

4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;

Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней (см. тетрадь).

Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.

Цель заражения куриных эмбрионов:

1. Выделить вырус из пат.материала;

2. Наработка вакцин;

3. Поддержание вируса в условиях лаборатории;

4. Титрация вирусов;

5. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

6. Изучение интерференции вирусов и наработка интерферона; Заражение куриных эмбрионов:

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе

Во время просвечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым карандашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места предлежания эмбрирна и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.

Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Доза заражения составляет 0,1-0,2 см.

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала:

1) Заражение на хорионаллантоисную оболочку, используют эмбрионы 7—12-суточного возраста при выделении и культивировании нейротропных, дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Существует 3 варианта заражения:

а) вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют подскорлупную оболочку и наносят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) материал. Отверстие в яйце затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края колпачка парафинируют;

б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скаль­пелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом удаляют участок скорлупы и подскордупной оболочки и вводят материал. Отверстие закрывают покровным стерильным стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным лейкопластырем.

в) скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью около 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью резиновой груши через отверстие в скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусственная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

2) Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для заражения берут 10-11-дневные эмбрионы. Имеется два варианта заражения:

а) заражение проводят через пугу, не срезая ее. Иглой отмеряют расстояние от верхушки пуги до границы пуги, отмеченной карандашом на скорлупе, и вводят иглу на отмеченную глубину и углубляют еще на 0,5 см, чтобы проколоть хорионаллантоисную оболочку;

б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте предлежания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом участке. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

3) Заражение в желточный мешок. Для заражения используют 5-8-суточные эмбрионы. Существует два варианта заражения:

а) иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок под углом 45° к месту предлежания эмбриона под контролем овоскопа;

б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к эмбриону на глубину около 1 см.

Место введения заклеивают лейкопластырем и парафинируют. 4) Заражение в амниотическую полость. При этом методе заражения вирус может проникнуть в различные клетки, находящиеся в контакте с амниотической жидкостью, и размножаться в них. для удобства заражения рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх и удобнее заражать. Имеется два варианта заражения:

а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную оболочку и захватывают амниона подтягивают амнион пинцетом и вводят в амниотическую полость материал в дозе 0,1 мл. Отверстие в скорлупе затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края парафинируют;

б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной комнате под контролем глаза, У иглы предварительно острие загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу доэмбриона, под давлением затупленной иглы эмбрион в этом случае будет смещаться, затем легким толчком прокалывают амнион и иглу слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх. Затем вводят материал.

5) Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Используются 7-12-дневные эмбрионы, заражение проводят введением материала в различные участки тела или непосредственно в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают пинцетом эмбрион. При этих методах заражения может быть гибель эмбрионов от травмы до 30 % и более от числа зараженных.

6) Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки. Этот метод заражения, как и предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда непосредственно в сосуд по току крови.

После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают путем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсичности патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

Вскрытие погибших зараженных куриных эмбрионов, или изъятых по истечении срока наблюдения производится со всеми правилами асептики в стерильных условиях бокса. При вскрытии скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, затем срезают пугу. У вскрытого эмбриона сначала тщательно отсасывают аллантоисную жидкость (количество ее около 7 мл), затем пинцетом оттягивают амниотическую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой и отсасывают амниотическую жидкость (количество ее 1,0-1,5 мл), затем собирают желток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Жидкость, оболочки и сам эмбрион тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотическая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она может быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной оболочке: появляютсявоспалительные очаги, непрозрачные, круглой формы и кровоизлияния. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.

Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, для аттенуирования (ослабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получения интерферона.

Дата добавления: 2014-11-25