Шкала Альтгаузена 1 страница

Клініко-діагностичне значення. Реакція сечі може змінюватися при деяких патологічних станах. Кисла реакція сечі спостерігається при цукровому діабеті, подагрі, голодуванні (внаслідок накопичення в сечі ацетонових тіл), а також при важкій нирковій недостатності. Лужна реакція спостерігається після прийому бікарбонатів, лужних мінеральних вод, при інфікуванні сечостатевих шляхів деякими мікробами, які викликають аміачне бродіння ще в порожнині сечового міхура.

С

Х – вміст білка в досліджуваній пробі, г/л;

А - екстинкція сироватки крові;

В - концентрація білка в стандартному розчині, г/л;

С - екстинкція стандартного розчину білка.

2. Визначення вмісту білка рефрактометричним методом.

Принцип методу. Метод грунтується на визначенні показника заломлення розчину білка. Відомо, що промінь світла, переходячи з одного середовища в інше, заломлюється. Відношення синуса кута падіння до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення:

sin α

------ = n

sin β

Величина показника заломлення сироватки крові залежить головним чином від вмісту білка в ній, інші складові частини мало впливають на ступінь рефракції.

Хід роботи. Спочатку встановлюють нульову точку шляхом визначення показника заломлення дистильованої води. Для цього за допомогою дзеркала направляють промінь світла на шкалу та рефрактометричну камеру. Відкривають рефрактометричну камеру і піпеткою наносять на нижню призму 1-2 краплі дистильованої води. Закривають рефрактометричну камеру і маховиком межу світлотіні вводять в центр перехрестя окуляра. Після цього рефрактометричну камеру відкривають, витирають воду марлею або фільтрувальним папером і наносять на призму 1-2 краплі досліджуваної сироватки крові. Закривають камеру і спостерігають в окуляр зміщення межі світлотіні. Повертаючи маховик знову встановлюють межу світлотіні в центр перехрестя окуляра. По шкалі відзначають показник заломлення, і, користуючись таблицею, визначають вміст білка в сироватці.

3. Визначення фракцій білка методом електрофорезу.

Електрофоретичний розподіл білків широко використовується для діагностики захворювань, препаративної роботи і дозволяє з суміші білків (сироватки крові) виділити окремі фракції.

Принцип методу грунтується на різній рухливості білків в електричному полі в залежності від заряду та молекулярної маси білка.

а) Електрофорез на папері дозволяє розділити білки сироватки крові на 5 фракцій і найчастіше використовується в медичній практиці.

Хід роботи. Смужку хроматографічного паперу 4х40 см змочують буферним розчином і на відстані 5-6 см від краю наносять мікропіпеткою 0,01-0,005 мл сироватки. Смужку вміщують в електрофоретичну камеру, ванни якої заповнені буфером, і проводять електрофорез при напрузі 220 вольт; сила струму 0,1-0,3 мА/см на 18-20 годин. Електрофореграми висушують при +105^oС 20 хвилин, занурюють в лоток з барвником (бромфеноловий синій) на 20 хвилин, промивають у 2% розчині оцтової кислоти і висушують на повітрі. З електрофореграми вирізають забарвлені смужки, які відповідають певним фракціям білка, подрібнюють і вміщують в пробірки з 5 мл 0,01 М розчину гідроксиду натрію на 1 годину. Для контролю вирізають смужку електрофореграми, яка не містить білка. Вимірюють екстинкцію в кожній пробірці. Суму цих показників приймають за 100% і, виходячи з цього, вираховують вміст білка в кожній фракції у відсотках.

Розрахунок. Наприклад, якщо сума екстинкцій всіх фракцій білка складає 0,58, а екстинкція альбуміну - 0,36, то вміст альбуміну по відношенню до загального білка всіх фракцій складає:

0,36 х 100

вміст альбуміну = -------------------- = 62%.

0,58

б) Електрофорез в поліакриламідному гелі широко застосовують в науково-дослідницькій роботі. Він дозволяє розділити білки сироватки крові на 20 фракцій, тому що розподіл білків відбувається не тільки в залежності від заряду, але і від розміру і форми частинок.

Клініко-діагностичне значення. У здорової людини вміст білка в крові коливається від 60 г/л до 80 г/л, зниження нижче 60 г/л - гіпопротиїнемія, збільшення вище 80 г/л - гіперпротиїнемія. Найчастіше гіпопротеїнемію спостерігають при голодуванні, порушенні функції кишечника, хворобах печінки та нирок. Причиною гіперпротеїнемії може бути втрата води організмом.

За допомогою електрофорезу білки сироватки можна ділити на фракції, які характеризують стан організму і використовуються для діагностики. Зменшення кількості альбумінів вказує на захворювання печінки, де вони синтезуються або втрату їх з сечею при патології нирок. Збільшення кількості глобулінів спостерігається при інфекційних процесах, а зменшення цієї фракції може свідчити про СНІД. Значне зниження альбумінів і підвищення всіх глобулінових фракцій відбувається при злоякісних пухлинах.

4. Фізико-хімічні властивості сечі.

Дослідження реакції сечі.

Принцип методу. Реакція сечі визначається шляхом порівняння кольору сечі, який отримується при додаванні до неї індикатору.

Досліджуваний матеріал, реактиви, обладнання: сеча; індикаторний (лакмусовий) папірець; 1% розчин бромтимолового синього (для роботи його розводять у 4 рази); пробірки; крапельниці.

а) Дослідження реакції на лакмус.

Хід роботи. Реакцію сечі визначають за допомогою синього і червоного лакмусового паперу. З цією метою краплю досліджуваної сечі наносять на лакмусові папірці і, в залежності від результатів, визначають кислу, нейтральну або лужну реакцію сечі (при кислій реакції лакмусовий папірець червоніє; при лужній - червоний папірець синіє; при нейтральній реакції папірці не змінюють свого кольору).

б) Визначення густини сечі.

Густина сечі при температурі 15^oС коливається від 1,015 до 1,025 і залежить від кількості розчинених в ній речовин. Ці коливання в фізіологічних умовах залежать від кількості рідини, яка поступає в організм і виділяється з нього іншими шляхами (з потом та ін.).

Принцип методу. Для визначення густини сечі користуються спеціальними ареометрами, які називаються урометрами. Урометри бувають двох типів: перший - для сечі з низькою і нормальною густиною (з поділками від 1,000 до 1,030), другий - для сечі з високою густиною (від 1,020 до 1,060).

Хід роботи. Сечу наливають у скляний циліндр з діаметром, що перевищує ширину циліндричної частини урометра. Якщо це не вдалося, піну знімають фільтрувальним папером.

Визначення починають першим урометром. Урометр потрібно занурювати повільно, щоб частина його вище рівня сечі залишалась сухою. Коли урометр перестає занурюватися, його потрібно злегка штовхнути зверху, після чого він, зробивши декілька рухів угору і вниз, зупиниться. У цей момент роблять відрахунок за нижнім меніском, тримаючи око на одному рівні з ним. У випадку високої густини для дослідження беруть другий урометр. Всі дослідження сечі проводять при температурі 15^oС, на яку розрахована шкала урометра. Якщо це не вдається, доводиться вносити поправку: на кожні 3^o вище 15^oC потрібно додавати, а на кожні 3^o нижче - віднімати по 0,001 від показників шкали урометра.

Клініко-діагностичне значення. При нормальній функції нирок сеча, виділена у великій кількості, має низьку густину; при виділенні меншої кількості сечі густина її більш висока. В нормі існує паралельна залежність між кількістю сечі, кольором і густиною. Густина сечі змінюється при ряді патологічних станів. Підвищення густини спостерігається при гарячкових захворюваннях, деяких хворобах нирок, цукровому діабеті, блюванні, проносі. Низька густина буває при тяжких розладах функції нирок, при нецукровому діабеті, при нервових захворюваннях.

в) Дослідження кількості, кольору, прозорості, запаху сечі.

Кількість сечі. Добова кількість сечі (діурез) у здорової людини коливається від 1200 до 1800 мл. Ці коливання в фізіологічних умовах залежать від температури зовнішнього середовища, від прийому рідини і від її виділення іншим шляхом (з потом та ін.). При ряді патологічних станів спостерігаються значні відхилення в кількості виділеної сечі. Збільшення кількості сечі - поліурія, може бути після вживання сечогінних і деяких серцевих засобів, при цукровому і нецукровому діабеті, нервових хворобах, захворюваннях нирок. Зменшення кількості сечі - олігурія, - при запаленні нирок, пороках серця, при гарячкових захворюваннях, внаслідок частих проносів, блюванні. Відсутність сечі - анурія, - при тяжкому порушенні видільної функції нирок (уремічний стан), при закупорці сечоводів і при отруєнні ртуттю, свинцем, миш’яком.

Колір сечі. Колір сечі зумовлений наявністю в ній пігментів урохрому, уробіліну, уроеритрину та інших і, звичайно, варіює між блідо-жовтим і насиченим червоно-жовтим. Інтенсивність забарвлення відповідає густині сечі. Сеча з високою густиною темніша, сеча з низькою густиною - світліша. Винятком є діабет, при якому сеча, незважаючи на дуже високу густину - бліда. Різні речовини ендо- або екзогенного походження можуть надавати сечі найрізноманітнішого забарвлення. Так, наприклад, червонуватого відтінку сеча набуває при наявності в ній крові, вживанні антипірину, пірамідону, сантоніну. В сечу можуть переходити пігменти моркви і буряків.

Коричневий колір може залежати від присутності в сечі великих кількостей жовчних пігментів, розкладеної крові. Оранжевий відтінок залежить від значної кількості уробіліну. Білуватий колір може бути зв’язаний з виділенням великої кількості фосфатів і при ліпурії, тобто виділенні жиру.

Колір сечі визначають у склянці з безбарвного скла у відбитому світлі на білому фоні.

Прозорість сечі. Нормальна свіжовипущена сеча - прозора. Проте, при недовготривалому стоянні (через 10-15 хв.) в ній часто з’являється ледве помітна каламуть у вигляді хмарки. Ця хмарка складається з муцину, слизу, епітеліальних клітин, інколи з домішкою кристалів, які не мають ніякого діагностичного значення.

При довготривалому стоянні сеча каламутніє внаслідок бактеріального розкладу сечовини з виділенням аміаку, що призводить до зміни реакції сечі і випадання в зв’язку з цим фосфорно- і вуглекислих солей кальцію і магнію. Слід відрізняти сечу, яка стала каламутною при стоянні, від сечі, що виділяється каламутною.

Каламуть свіжовипущеної сечі залежить головним чином, від наявності уратів, фосфатів, оксалатів або карбонатів, а також від наявності слизу, гною, епітелію, мікробів. Каламуть, що обумовлена уратами, зникає при нагріванні або при додаванні лугу. Фосфати утворюють білий плівчастий осад, який розчиняється в кислотах, а каламуть, викликана присутністю гною, не зникає ні при нагріванні, ні при додаванні кислот і лугів. Розрізняють прозору, каламутнувату, каламутну і молочно-каламутну сечу. Точне розпізнання причини каламуті можливе лише під мікроскопом. Прозорість сечі визначають у склянці з безбарвного скла після збовтування.

5. Якісна реакція на білок.

Сеча здорової людини практично не містить білка. Сліди його, що містяться в сечі, звичайними реакціями, якими користуються в клініці, не виявляються. При ряді захворювань з сечею може виділятись значна кількість білка, що носить назву протеїнурії або альбумінурії.

Розрізняють справжню альбумінурію і несправжню. При справжній або нирковій протеїнурії білки сироватки крові попадають в сечу через нирки. Несправжня протеїнурія спостерігається при попаданні в сечу слизу, крові, гною не з нирок, а з сечовивідних шляхів. Для виявлення білка в сечі використовують реакції осадження з допомогою азотної і сульфосаліцилової кислот. Остання – дуже чутлива.

Клініко-діагностичне значення. Білок з’являється в сечі при нефриті (тобто при запаленні судинних клубочків нирок, коли збільшується їх проникливість), у випадках серцевої декомпенсації, при деяких формах підвищеного тиску та, іноді, при вагітності.

6. Кількісне визначення білка за методом Робертса-Стольникова.

Принцип методу. Метод грунтується на емпірично встановленому факті, що при нашаруванні сечі на азотну кислоту спостерігається стійке помутніння у вигляді кільця на межі обох рідин між 2-ю і 3-ю хвилинами при вмісті в сечі 0,033 г/л білка. Користуючись різними розведеннями сечі, знаходять таке розведення, яке дає утворення білого кільця через 2-3 хвилини.

Хід роботи. Попередньо за допомогою якісних реакцій визначають наявність білка в сечі. Для цього використовують дуже чутливу реакцію з сульфосаліциловою кислотою - в пробірку вміщують 1 мл сечі і додають 3 краплі 20% розчину сульфосаліцилової кислоти. При наявності білка в сечі утворюється білий осад. Для визначення кількості білка треба зробити розведення сечі - в 5 пробірок наливають по 2 мл дистильованої води. В першу додають 2 мл досліджуваної сечі. Вміст цієї пробірки перемішують і 2 мл суміші переносять в другу пробірку, з другої - в третю і так далі, із останньої пробірки 2 мл суміші виливають. Отримують розведення сечі в 2, 4, 8, 16, 32 рази. Кожну порцію розведеної сечі обережно нашаровують на азотну кислоту, 1 мл якої вміщують в пробірку. Відзначають при якому розведенні з’являється біле кільце між 2-ю і 3-ю хвилинами.

Для розрахунку вмісту білка в сечі 0,033 г/л перемножують на ступінь розведення сечі в пробірці, де утворилося біле кільце між 2-ю і 3-ю хвилинами. Наприклад, кільце утворилося в пробірці, де було розведення сечі в 8 разів. Тоді, 0,033 х 8 = вміст білка в сечі в г/л.

7. Якісне та кількісне визначення глюкози в сечі.

З сечею здорової людини за добу виділяється до 0,02% глюкози, яка не визначається звичайними методами. Тому можна вважати, що практично з сечею глюкоза не виділяється. Це явище тісно пов’язане з існуванням ниркового порогу. Нирковий поріг - це та максимальна концентрація глюкози, яка повністю реабсорбується в ниркових канальцях назад в кров. В нормі нирковий поріг становить 8-10 ммоль/л. Поява глюкози в сечі називається глюкозурією. Причинами, які приводять до її появи в сечі можуть бути: а) гіперглікемії, рівень яких перевищує нирковий поріг; б) захворювання нирок, що пов’язані з порушенням реабсорбції глюкози у ниркових канальцях. Якісні реакції грунтуються на редукуючих властивостях альдегідної групи глюкози. Як окислювач беруть речовини, які при відновленні утворюють забарвлені розчини. Вони називаються пробами Фелінга, Тромера, Ніландера та ін. Ці реакції неспецифічні, тому що ряд фізіологічних та патологічних інгредієнтів (креатин) і деякі лікарські речовини (антипірин, камфора, ПАСК, антибіотики та ін.) мають також відновлюючі властивості.

7.1. Реакція Тромера.

Принцип методу. Реакція грунтується на відновленні окисної міді у закисну.

Хід роботи. В пробірку наливають 1-2 мл сечі і доливають рівний об’єм їдкого натру. По краплях додають розчин мідного купоросу до появи незникаючої каламуті гідроокису міді. Обережно нагрівають верхню частину вмісту пробірки. Поява жовтого забарвлення гідрату закису міді, яке переходить в червоно-цеглясте (закис міді), вказує на позитивну реакцію Тромера.

7.2. Реакція Фелінга.

Принцип методу з реактивом Фелінга такий самий, як і при реакції Тромера. Перевагою рекції Фелінга є те, що мідь при надлишку реактиву не утворює окису міді. Реакція зупиняється на стадії утворення закису міді червоного кольору, що дозволяє чітко визначити кінець реакції.

Хід роботи. До 1-2 мл сечі додають рівний об’єм реактива Фелінга та нагрівають. У випадку наявності глюкози в сечі спостерігають утворення осаду червоно-цеглястого кольору закису міді.

7.3. Уніфікований метод визначення глюкози в сечі за допомогою індикаторних смужок “Глюкотест”.

Принцип методу. Метод грунтується на специфічному окисленні глюкози ферментом глюкозооксидазою до глюконової кислоти в присутності молекулярного кисню. Зміна забарвлення барвника свідчить про наявність глюкози в сечі.

Реактивний папірець “Глюкотест”- це смужка паперу 0,5х0,5 см, який має поперечну смужку світло-жовтого кольору насичену розчином ферментів (глюкозооксидазою, пероксидазою), о-толідином, цитратним буфером, желатиною та жовтим барвником аураміном. Аурамін змінює своє забарвлення від жовтого до темно-синього при наявності в сечі глюкози більше 2%. З допомогою глюкотесту можна виявити глюкозу в сечі і визначити її концентрацію. Цей метод має високу субстратну специфічність і дозволяє виявити в сечі концентрацію глюкози від 0,03 до 0,5 % та вище.

Хід роботи. Смужку “глюкотесту” занурюють у свіжозібрану досліджувану сечу. Після цього швидко її виймають і на 2 хв залишають на пластмасовій пластинці. Потім порівнюють змінене забарвлення кольорової смужки на папері з кольоровою шкалою, яка є в комплекті. Вміст глюкози в сечі визначають по найбільш співпадаючому зі шкалою кольору смужки.

7.4. Кількісне визначення вмісту глюкози в сечі методом Альтгаузена.

Принцип методу. Метод базується на тому, що сеча, яка містить цукор при кип’ятінні з лугом набуває різних відтінків коричневого кольору (від жовтого до темно-бурого). Продуктами реакції є молочна кислота та гумінові речовини.

Хід роботи. 4-5 мл сечі змішують в пробірці з 1мл 10% їдкого натрію або калію; кип’ятять 1 хвилину і залишають на 10 хвилин в штативі. При наявності цукру в сечі в пробірці утворюється один з відтінків стандартної шкали Альтгаузена.

Готують вихідний стандартний розчин. Для цього до сечі, яка не містить цукор, додають глюкозу з такого розрахунку, щоб її концентрація дорівнювала 4%. З цього розчину при розведенні сечі, яка не містить цукор, готують розчини різної концентрації за схемою:

№ Вихідний станд. Сеча, яка не містить Одержана концентрація

пробірки розчин (в мл) цукор (в мл) цукру в сечі, %

1 0,5 3,5 0,5

2 1,0 3,0 1,0

3 1,5 2,5 1,5

4 2,0 2,0 2,0

5 2,5 1,5 2,5

6 3,0 1,0 3,0

7 3,5 0,5 3,5

До всіх пробірок додають по 1 мл 10% лугу та кип’ятять.

Клініко-діагностичне значення. Якісне та кількісне визначення цукру в сечі має велике діагностичне та прогностичне значення. Глюкозурія може зустрічатися при цукровому діабеті, гострих запальних захворюваннях підшлункової залози, гіпертіреозі, акромегалії, синдромі Іценко-Кушінга, при захворюваннях печінки, внаслідок порушення синтезу глікогену, запальних процесах нирок, вагітності, надмірному вживанні вуглеводів з їжею.

7.5 Вплив цукрового навантаження на рівень цукру в крові.

Хід роботи. У досліджуваного натще беруть з пальця кров і визначають в ній вміст цукру.Після цього дають випити розчин глюкози у воді з розрахунку 1 г глюкози на 1 кг маси тіла. Потім протягом 3-ох годин через певні інтервали повторно забирають кров і визначають в ній вміст глюкози ортотолуїдиновим методом. На основі отриманих даних потрібно побудувати цукрову криву, відкладаючи на вертикальній осі кількість цукру в ммоль/л, а на горизонтальній - час в хвилинах. Кров рекомендують брати через 15, 30, 90, 180 хв. У здорової людини вже через 15 хв після прийняття глюкози спостерігається збільшення цукру в крові, яке досягає свого максимуму в проміжку від 30-ї до 60-ї хвилини. Після цього починається зниження цукру. Через 120 хв його рівень може бути навіть нижчий за вихідний. Через 180 хв рівень цукру, як правило, нормалізується.

Клініко-діагностичне значення. Метод цукрового навантаження дозволяє виявити скриті форми діабету, порушення глікогенутворюючої функції печінки та вплив інсуліну на вуглеводний обмін.

8. Проба Легаля на ацетон.

Принцип методу. Ацетон і ацетооцтова кислота з нітропрусидом натрію в лужному середовищі утворюють продукти реакції забарвлені в червоний колір. При додаванні крижаної оцтової кислоти утворюється комплексна сіль вишнево-червоного кольору.

Хід роботи. У дві пробірки наливають по 0,5 мл сечі: в першу - здорової людини (контроль), в другу - хворого на цукровий діабет. В обидві пробірки додають по 0,5 мл розчину їдкого натрію і по 5-7 крапель нітропрусиду натрію. Спостерігають за появою червоного забарвлення в другій пробірці (сеча хворого). Підкислюють розчин декількома краплями концентрованої оцтової кислоти. Червоне забарвлення набуває вишневого відтінку. Реакція Легаля малоспецифічна. Креатинін сечі при взаємодії з нітропрусидом натрію утворює аналогічне забарвлення, але в такому разі при додаванні концентрованої оцтової кислоти рідина не забарвлюється у вишневий колір.

9. Бензидинова проба на гем гемоглобіну.

Принцип методу. Гемоглобін складається з 4-ох субодиниць, кожна з яких містить білок глобін і простетичну групу - гем, який надає крові червоного забарвлення. Виявлення гемінової групи грунтується на її здатності окислювати бензидин за допомогою перекису водню, утворюючи сполуку синього кольору, що поступово може переходоти в червоний. Ця дуже чутлива реакція використовується для виявлення навіть мінімальних кількостей крові в біологічних рідинах і широко застосовується в клінічній та судовій медицині.

Хід роботи: В пробірку вміщують 5 крапель 1% розчину крові, 5 крапель розчину бензидину, 2-3 краплі пероксиду водню і спостерігають за появою синього забарвлення.

Лiтература.

1. Конспект лекцій.

2. Биологическая химия /Воронина Л.Н. и др.- Х.:Основа, 1999.

3. Губський Ю.I. Бiологiчна хiмiя. – Київ-Тернопiль: Укрмедкнига, 2000

4. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.:Медицина, 1999.

5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. – Біохімія людини, 2000.

Заняття № 8

Тема: Фармацевтична біохімія.

Актуальність теми: Знання процесів метаболізму лікарських речовин використовується для вирішення ряду задач біофракції, фармакології, фармацевтичної хімії, технології ліків. Результати і узагальнення фармацевтичної біохімії є тією фундаментальною основою на базі якої розвивається наукова і раціональна фармакотерапія захворювань та їх фармакопрофілактика. Вивчення метаболізму ліків в органах і тканинах організму (біотрансформація ліків) дозволяє розробити ефективну медикаментозну терапію, створювати нові лікарські середники і встановлювати механізми їх дії.

Навчальні цілі:

Знати: стадії метаболізму ліків, вплив метаболізму ліків на їх фармакологічну активність, реакції кон'югації лікарських речовин та їх метаболіт. Метаболічні перетворення ліків у першій та другій фазі, ферменти та їх локалізацію у клініці.

Вмiти: Визначати біологічну доступність (БД) лікарських речовин і давати їм фармакологічну оцінку. Оцінювати вплив різних факторів на метаболізм та фармакологічну активність ліків для ефективності індивідуальної фармако-терапії та визначення інтенсивності гідроксилювання лікарських речовин мікросомами печінки.

Самостiйна позааудиторна робота:

1. Перечислити і охарактеризувати стадії метаболізму лікарських речовин.
2. Охарактеризувати систему мікросомального окислення.
3. Написати схеми реакцій С-гідроксилювання бутаміду, бензолу, N-гідроксилювання сульфаніламіду, дезалкілювання фенацетину, відновлення нітробензолу, гідролізу іпроніазиду.
4. Охарактеризувати процеси кон'югації і написати реакції: а) саліцилової кислоти з глюкуроновою; б) метилювання ізоніазиду; в) ацетилювання сульфаніламіду; г) ПАСК з гліцином.

Контрольнi питання:

1. Предмет і задачі фармацевтичної біохімії, значення її для біофармації, фармакології, медицини і токсикології.

2. Біогенні лікарські речовини та чужорідні ліки (ксенобіотики).

3. Стадії метаболізму ліків: а) ентеральний обмін в ШКТ; б) транспорт лікарських речовин через мембрани; в) перенесення лікарських речовин кров’ю, зв’язування з білками крові; г) міжтканинний розподіл лікарських речовин; д) внутрішньоклітинний метаболізм ліків (реакції біотрансформації); е) виведення із організму ліків та їх метаболітів.

4. Вплив метаболізму ліків на їх фармакологічну активність.

5. Реакції першої фази метаболізму ліків.

6. Гідроксилювання лікарських речовин у процесі мікросомального окислення. Характеристика ферментативної системи і механізм реакцій.

7. Інтенсивність метаболізму ліків як фактор індивідуальної чутливості організму до їх дії.

8. Процеси кон'югації лікарських речовин та їх метаболітів: утворення глюкуронідів, сульфатна, метильна, ацетатна і пептидна кон'югація.

9. Фармакокінетика, визначення і оцінка фармакокінетичних показників (біологічної доступності – БД і періоду напів-виведення – Т1/2).

Самостiйна робота на заняттi:

1. Виконати лабораторну роботу „Визначення гідроксилазної активності мікросом печінки”.

1. Визначення гідроксилазної активності мікросом печінки.

Принцип методу. Метод базується на визначенні вмісту 4-амінофенолу, який утворюється при гідроксилюванні аніліну в монооксигеназному ланцюгу мікросом. При взаємодії 4-амінофенолу з фенолом у присутності карбонату натрію утворюється синій індофенольний комплекс.

Хід роботи. Із печінки тварин шляхом гомогенізації та диференціального центрифугування отримують суспензію мікросом, в якій біуретовим методом визначають концентрацію білка. У дві пробірки (дослідна і контрольна проба) вносять по 0,4 мл трис-НСІбуферну (рН 7,4), 0,4 мл 0,16 М розчину хлориду магнію, 0,1 мл суспензії мікросом, 0,2 мл 0,03 М розчину НАДФН і 0,15 мл 0,03% розчину аніліну. Потім до контрольної проби додають 0,5 мл 15% розчину трихлороцтової (ТХО) кислоти. Обидві пробірки поміщають на 20 хв. у термостат при 37^оС. По закінченні інкубації в дослідній пробі зупиняють реакцію добавленням 0,5 мл 15% розчину ТХО. У дослідну пробірку вносять 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію і 1,5 мл 2% розчину фенолу, а в контрольну – 2 мл дистильованої води, добре перемішують. Через 10 хв. колориметрують дослідну пробірку проти контрольної на ФЕКу при 630 нм (червоний світлофільтр) у кюветах товщиною 10 мл.

Розрахунок проводять за формулою:

Х= А · V/20m,

де Х – гідроксилазна активність, нмоль/хв · мг білка;

А – концентрація амінофенолу в пробі, знайдена за калібрувальним графіком, нмоль; V - об’єм проби, рівний 1,75 мл; 20 – час інкубації, хв; m – вміст білку в пробі, мг (приблизно 2-4 мг/0,1 мл суспензії мікросом).

2. Визначення ацетилювальної здатності організму на прикладі сульфаніламідів.

Ацетилювання сульфаніламідів – основний шлях їх метаболізму. Ацетильовані форми неактивні і виводяться з сечею. Частина сульфаніламідів виділяється з сечею у незміненій формі. Тому ступінь ацетилювання сульфаніламідів вказує на співвідношення бактеріостатично активної і неактивної форм препаратів. Чим швидше ацетилюється сульфаніламід, тим менша його бактеріостатична активність. Крім того, за ступенем ацетилювання визначають активність ферментної системи, яка каталізує реакцію ацетильної кон’югації різних сполук.

Принцип методу. Метод дослідження ацетилювальної здатності організму грунтується на визначенні концентрації вільного сульфаніламіду в сечі та загальної суми вільної і цетильованої форм після гідролізу останньої. Концентрацію сульфаніламіду визначають за інтенсивністю забарвлення комплексу діазотованого сульфаніламіду з резорцином.

Хід роботи. Лабораторним тваринам (щурам чи кроликам) вводять перорально порошок норсульфазолу або сульфадилметоксину в дозі 0,3 г на 1 кг маси тіла у вигляді суспензії в 3 мл води. Тварин утримують 1 добу в обмінних клітках, збирають сечу і фільтрують. У дві пробірки (перша для визначення загального сульфаніламіду, друга - вільного) відмірюють по 1 мл розведеної у 20 раз сечі, по 1,5 мл води і по 0,25 мл 10% розчину соляної кислоти. В третю пробірку (контрольна проба) вносять 2,5 мл води і 0,25 мо 10% розчину НС1. Першу пробірку (для визначення сульфаніламіду) закривають корком і ставлять для гідролізу в кип’ячу водяну баню на 15 хв. Потім пробірку охолоджують.

У всі три пробірки додають по 2 краплі 0,5% свіжоприготовленого розчину нітріту натрію і старанно перемішують. Через 10 хв. до проб доливають 1,5 мл насиченого розчину ацетату натрію і 0,25 мл свіжоприготовленого 0,5% розчину резорцину, перемішують і залишають на 15 хв. для розвитку забарвлення.

Дослідні проби фотометрують на ФЕКу (синій світофільтр) у кюветах шириною 5 мм проти контрольної проби. Розрахунок виконують за формулою:

Х = Е₁ – Е₂ · 100,

Е₁

де Х – ацетилювальна здатність організму, % ацетильованого сульфаніламіду;

Е₁ – оптична густина проби із загальним сульфаніламідом;

Е₂ – оптична густина проби із вільним сульфаніламідом

3. Визначення БД сульфаніламідів.

Важливим біофармацевтичним показником для оцінки якості ліків є біологічна доступність (БД), яка визначається відносною кількістю речовини (із дози введеної у вигляді лікарської форми), що надходить до загального кола кровообігу і взаємодіє з тканинними рецепторами. БД залежить від хімічної будови речовини, технології виготовлення лікарської форми і здатності речовини вивільнятись із лікарської форми, ступеня абсорбції речовини при ентеральному введенні з травного каналу в кров, швидкості транспорту при парентеральному введенні, швидкості біотрансформації. Найвища БД досягається шляхом внутрішньо судинного введення лікарської речовини (для порівняння приймається за 100%).

Практичне значення роботи. Аналіз результатів визначення БД після одноразового введення лікарської речовини дозволяє визначити картину фармакокінетики препарату в організмі, встановлювати час досягнення піку концентрації, тривалість знаходження в організмі. Вивчення БД необхідне для порівняльної оцінки якості декількох лікарських форм одного і того ж лікарського середника, технології виробництва, контролю стабільності у процесі зберігання.

Дата добавления: 2014-11-18