Виготовлення парафінових зрізів

Техніка проведення фарбування

Фарбування за Грамом відноситься до складного способу фарбування, коли на мазок впливають двома фарбниками, з яких один є основним, а інший — додатковим. Окрім фарбувальних речовин при складних способах забарвлення застосовують обезбарвлюючі речовини: спирт, кислоти та ін. Для фарбування за Грамом частіше використовують барвники трифенілметанової групи: генціановий, метиловий фіолетовий або кристал віолет. Грам-позитивні (Грам (+)) мікроорганізми дають міцне з'єднання з вказаними барвниками і йодом. При цьому вони не обезбарвлюються при дії на них спиртом, унаслідок чого при додатковому забарвленні фуксином Грам (+) мікроорганізми не змінюють спочатку приєднаний фіолетовий колір. Грам-негативні (Грам (-)) мікроорганізми утворюють з основними барвниками і йодом з'єднання, що легко руйнується під дією спирту. В результаті мікроби обезбарвлюються і потім забарвлюються фуксином, набуваючи червоного кольору. Матеріал, що досліджується, розподіляють тонким шаром по поверхні добре знежиреного скла. Приготований мазок висушують на повітрі і після повного висихання фіксують.

Після ущільнення матеріалу виготовляють зрізи, проводять це на спеціальних апаратах – мікротомах, а процес називають мікротомування. Готують зрізи за допомогою мікротомних ножів. Це стальні клинки однакової ширини, але різні за формою та довжиною. Залежно від якості сталі мікротомні ножі бувають трьох марок – А, В, С. Ножі марки А мають плоско-вгнуту форму з великою кривизною, вони виготовлені із м’якої сталі та використовуються для зрізів, що залиті в целоїдин. Ножі марки В виготовлені із більш твердої сталі, вони також мають плоско-вгнуту форму, але з меншою кривизною. Ножі марки В використовуються для виготовлення зрізів, що залиті в целоїдин. Ножі марки С виготовляють з найтвердішої сталі, вони мають плоску поверхню і застосовуються для виготовлення парафінових і заморожуючих зрізів. Мікротомні ножі фіксуються на мікротомах. Усі мікротоми незалежно від виду мають:

Станину, яка служить для кріплення і монтажу деталей мікротома.

Тримач ножа, що дозволяє регулювати нахил ножа

Предметний столик або об’єкт отримач, що призначений для фіксації блоків

Механізм мікроподачі, який служить для автоматичної подачі об’єкта до ножа, що дозволяє корегувати товщину зріза.

Мікротоми бувають санні, заморожувальні, р отаційні та кріостати.

Санний мікротом отримав свою назву завдяки конструкції, у нього ніж і об’єктотримач знаходяться на санях або вільно ковзають по рейках. Вони бувають двох конструкцій, в одних мікротомах підйом об’єкта здійснюється по похилій площині, в інших – подача блоку по вертикалі.

Заморожувальні мікротоми використовуються для готування зрізів методом заморожування. Вони мають спеціальний столик для заморожування, це термоелектричний столик або металевий столик, який заповнений вуглекислотою.

Ротаційні мікротоми призначені для різання об’єктів, що залиті в органічні наповнювачі. У них об’єкт за допомогою спеціального механізму рухається горизонтально або вертикально і насуває на укріплений нерухомо ніж.

Мікротом-кріостат використовують для отримання зрізів із свіжозаморожених тканин і органів при експрес біопсії. Це термоізоляційна камера з мікротомом та охолоджуючою системою. Така камера має подвійні стінки, між якими знаходиться термоізоляційний матеріал. Передня стінка є дверима, в які вмонтовано оглядове скло та закриті діафрагмою отвори для рук.

Отримані зрізи на мікротомі необхідно наклеювати на предметні або накривні скельця, які повинні бути цілком чистими і добре знежиреними. Скельця миють у розчині мила, потім промивають у дистильованій воді, висушують та знежирюють у етанол-ефірі.

На висушені предметні скельця приклеюють зріз. Для цього одну поверхню предметного скельця вкривають тонким шаром суміші білка з гліцерином. Зрізи з мікротомного ножа переносять у теплу воду, де вони розправляються, потім їх виловлюють на поверхню скла, дають стекти воді та предметні скельця поміщають у термостат на 6 годин.

Перед фарбуванням зріза необхідно видалити парафін. Для депарафінування готують «батарею» з баночок, у які наливають один з розчинників парафіну (ксилол, бензол, толуол) та етаноли зменшуючої концентрації. Остання баночка з водою, після якої проводять фарбування.

Дата добавления: 2014-11-20