Оценка индукции синтеза ДНК клетками млекопитающих

Исследования в опытах на клетках млекопитающих

Первоначально считалось, что культуры клеток млекопитающих будут идеальным объектом для изучения мутагенной активности токсикантов. Однако в процессе работы, вскрылись обстоятельства поколебавшие эти представления. Прежде всего клетки многих тканей трудно культивировать, у многих из них практически отсутствует способность к клонированию, метаболическая активность клеток недостаточна. В настоящее время в исследованиях предпочтение отдают культурам клеток перевиваемых линий (например, овариальные клетки китайского хомячка, клетки мышиной лимфомы и т.д.). Однако чувствительность этих клеток к ксенобиотикам уже отличается от чувствительности клеток первичных тканевых культур.

Исследования по оценке мутагенности обычно проводят, изучая изменения резистентности клеток к: 8-азагуанину или 6-тиогуанину (определяется активностью гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы - ГГФРТ); бромдезоксиуридину или трифтортимидину (определяется активностью тимидинкиназы - ТК); оуабаину (определяется активностьюNa/К-АТФазы).

ГГФРТ регулирует инкорпорацию пуринов из среды в клетку. Мутация локуса ДНК, ответственного за синтез энзима, приводит к угнетению ферментативной активности, прекращению транспорта пуринов в клетку, в том числе и их токсичных аналогов. Мутировавшие клетки выживают в среде, содержащей аза- и тиогуанины.

ТК активирует транспорт пиримидинов. Мутация лкуса ДНК, ответственного за синтез ТК, делает клетку не чувствительной к токсическому действию токсичных аналогов пиримидина.

Оуабаин убивает клетки, взаимодействуя сNa/К-АТФазой. Мутация локуса, ответственного за синтез этого энзима изменяет его сродство к токсиканту, увеличивает резистентность клетки к яду.

Наиболее часто используется модель мутации ТК локуса в опытах с культурой клеток мышиной лимфомы (иногда с добавлением в инкубационную средуS-9 фракции гепатоцитов). После воздействия исследуемого токсиканта оценивается количество клеток, способных образовывать колонии в среде, содержащей бромдезоксиуридин.

В настоящее время описано множество других тест-объектов, на которых можно проводить подобные исследования.

Принцип метода заключается в оценке интенсивности репаративных процессов, инициируемых химическим повреждением ДНК. В основе метода лежит авторадиографическое определение степени инкорпорации меченного тритием тимидина в ядра клеток, предварительно обработанных обследуемым веществом.

Исследования обычно выполняются на гепатоцитах взрослых крыс самцов, диспергированных в инкубационной среде с последующей спонтанной адгезией на стеклянные подложки. В качестве положительного контроля используют гепатоциты, обработанные веществами, вызывающими повреждение ДНК и стимулирующими процесс её репарации: афлатоксином В₁ или 2-ацетиламинофлюореном; отрицательные контроли - гепатоциты не подвергавшиеся воздействию. Перед исследованием клетки на определенное время помещают в среду, содержащую обследуемый токсикант. Выбор концентрации вещества осуществляется в ходе предварительных опытов, путем определения кривой зависимости "доза-эффект" по показателю жизнеспособность клеток (окраска обработанных веществом клеток трипановым синим). После воздействия клетки отмывают и помещают в среду, содержащую тимидин, меченый тритием. После инкубации их высушивают, фиксируют и покрывают эмульсией для авторадиографического исследования. Спустя определенный экспозиционный период (обычно несколько недель) производят подсчет числа оптически плотных гранул над областью ядра клеток, отражающих степень инкорпорации тимидина. Поскольку гепатоциты обладают высокой способностью к репарации, чем выше степень инкорпорации тимидина, тем большее повреждение ДНК вызвал исследуемый агент.

Недостатком метода является то, что с его помощью невозможно оценить, приводит ли процесс репарации к формированию ошибок генетического кода (формируются ли мутации), то есть решить, является ли инициированное повреждение ДНК пагубным для клетки.

Дата добавления: 2014-12-08