Методи імунофлюоресценції

Методи, які базуються на дослідженні поверхневих маркерів лімфоцитів

Метод радиальної імунодифузії у гелі

Метод був запроновані Манчіні (Manchini та інші, 1964) і є найбільш розповсюдженим у клініці завдяки простоті та надійності.

Суть методу. На планшет рівномірно наносять гель агару (агарози), до якого додані антитіла до імуноглобулінів відповідного класу (анти-Ig). Після затвердіння у гелі вирізають лунки, які заповнюють досліджуваною біологічною рідиною (наприклад, сироваткою крові). Молекули антигену (у нашому випадку, Ig відповідного класу) радіальне дифундують із лунки і, зустрівшись із антитілами, утворюють коло преципітації. Площа утвореного преципітату прямо пропорційна логарифму концентрації імуноглобулінів у досліджуваній рідині

При постановці реакції використовують декілька стандартів з відомою концентрацією антигену. Шляхом побудови калібрувальної кривої або математичного обчислення визначають кількість антигена у зразках.

Визначення кількості імуноглобулінів важливе при діагностичному та клінічному моніторингу первинних імунодефіцитів, моноклональних гаммапатій, аутоіммуних захворюваннях та інших патологіях.

Середній вміст імуноглобулінів для різних вікових груп:

Вікові групи	Кількість іммуноглобулінів
Ig G	Ig A	Ig M
Середнє значення	коливання	Середнє значення	коливання	Середнє значення	коливання
До 1 року		33-109		14-80		47-154
1-3 р.		62-143		33-143		55-180
3-7р.		70-168		58-201		64-176
7-16р.		72-172		80-319		63-172
20-35 р		86-195		128-359		69-206
19-60 р.		95-235		55-250		6-405

Клінічне значення оцінки популяціонного складу лімфоцитів:

Кількісна оцінка хелперів/індукторів та цитотоксичних Т-лімфоцитів, а також визначення їх співвідношення (іммунорегуляторний індекс) важливі при дослідженні імунної системи та моніторингу пацієнтів з імунодефіцитним станом, аутоімунними захворюваннями або імуними реакціями, такими, як реакція відторгнення трансплантанту або трансплантант проти хазяїна.

Лікар повинен звертати увагу на відповідність характеру відхилення показників, що мають значення при тій чи іншій патології.

На сьогодні для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів та низки інших клітин використовують три групи методів:

1) методи імунофлюоресценції;

2) імуноферментні методи;

3) розеткоутворення.

Найпрогресивнішим і найточнішим методом ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів сьогодні є метод лазерної проточної цитофлюориметрії.

Флюоресцентні методи базуються на такому феномені: молекули антитіл поєднати з молекулами флюоресцентних барвників, то їхня специфічна активність у плані приєднання до відповідних антигенів повністю зберігається.

Прямий метод імунофлюоресценції полягає у використанні анти-СD-моноклональних антитіл, до яких приєднана флюоресцентна мітка (найчастіше-ФІТЦ), який дає в ультрафіолетових променях зеленувате свічення). У таблиці наведені диференціювальні антигени лімфоцитів, які можна виявити за допомогою відповідних моноклональних антитіл. Сьогодні розроблені гібридомні технології отримання моноклональних антитіл до відповідних антигенів мембран клітин. Визначення можна проводити як у суспензії лімфоцитів, так і у цільній крові. Обов'язковим етапом є інкубація клітин з моноклональними антитілами, кон’югованими з фітохроами, зокрема ФІТЦ. Результати обраховують за допомогою проточного цитофлюориметра, який ідентифікує клітини за розмірами (популяції лімфоцитів, моноцитів, гранулоцитів), за інтенсивністю свічення (чисельність субпопуляцій, щільність рецепторів на мембранах клітин).

При відсутності у лабораторії прилада - проточного цитофлюориметра - можна для підрахунку клітин використовувати флюоресцентний мікроскоп. При спостереженні у мікроскоп клітин, оброблених міченими антитілами, можна виявити характерні зони свічення у вигляді кол (німбів), які вказують на те, що на поверхні даної клітини експресовані відповідні диференційні антигени.

Дата добавления: 2014-12-17