Определение количества белка в ликворе с сульфосалициловой кислотой

Химическое исследование

Ликвор имеет сложный биохимический состав. Он содержит белки, аминокислоты, витамины, ферменты, гормоны, минеральные вещества. Спинномозговой жидкости свойственно постоянство химического состава с незначительным содержанием белка.

Белок. В норме содержание белка в ликворе, полученном при люмбальной пункции, составляет 0,2-0,3 г/л. Максимальное увеличение количества белка характерно для венозного застоя в ЦНС, особенно при сочетании застоя с нарушением циркуляции жидкости, что наблюдается при опухолях спинного мозга (до 20г/л и более). Значительное повышение белка в ликворе бывает при субарахноидальных кровоизлияниях. При воспалительном процессе оболочек мозга количество белка также увеличивается, но не в такой степени, как при застойной жидкости.

Для выявления повышенного содержания белка в ликворе используется реакция Панди (качественная проба на белок).

Определение глобулинов осаждением с карболовой кислотой (реакция Панди)

Принцип. Реакция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты.

Реактив: насыщенный раствор карболовой кислоты. 100г карболовой кислоты растворяют в 1л воды, встряхивают и оставляют стоять вначале в термостате при 37˚С на 6-8 часов, а затем при комнатной температуре 7 дней. Сливают надосадочную жидкость, которая используется в качестве реактива.

Ход исследования. На часовое стекло или стекло с лункой, помещенное на черную бумагу, наливают 1мл реактива и по краю наслаивают 1-2 капли ликвора.

Оценка результатов. В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с ликвором образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть. Для обозначения результатов пробы Панди пользуются системой четырех плюсов: слабая опалесценция 1+, заметная опалесценция 2+, умеренное помутнение 3+, значительное помутнение 4+.

Количественное определение белка в ЦСЖ проводят унифицированным методом с 6% сульфосалициловой кислотой.

Принцип. Сульфосалициловая кислота вызывает коагуляцию белка с образованием мутности, интенсивность которой пропорциональна концентрации белка.

Реактивы. 1. 6% раствор сульфосалициловой кислоты (ССК). 2. 14% раствор сульфата натрия (безводного). 3. Рабочий раствор – готовят перед употреблением путем смешивания равных объемов реактивов 1 и 2. 4. 0,9% раствор хлорида натрия. 5. 1% раствор альбумина для построения калибровочного графика.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход исследования. В пробирку (опыт) наливают 5мл свежеприготовленного рабочего раствора и 0,5мл ликвора. В другую пробирку (контроль) наливают 5мл 0,9% раствора хлорида натрия и 0,5 мл ликвора. Тщательно перемешивают содержимое обеих пробирок. Через 10 минут измеряют интенсивность помутнения на ФЭКе при длине волны 410-480нм (сине-фиолетовый светофильтр) в кювете 10мм, против содержимого контрольной пробирки. Расчет количества белка ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из калибровочного раствора готовят разведения и обрабатывают их как опытную пробу. В 5 пробирок наливают соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1мл раствора альбумина и в каждую из них доливают 0,9% NaCl до объема 10мл. Концентрация белка в этих растворах составляет соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1г/л.

Белки спинномозговой жидкости состоят из двух основных фракций: альбуминов и глобулинов. Отношение глобулиновой фракции к альбуминам колеблется в пределах 0,2-0,3 (2:10-3:10). При воспалительных заболеваниях происходит увеличение количества в основном крупнодисперсных белков-глобулинов, что и выявляется глобулиновой реакцией Нонне-Апельта.

Определение глобулинов высаливанием (реакция Нонне-Апельта)

Принцип. Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации (полунасыщенного раствора сульфата аммония) осаждать избирательно глобулины.

Реактив: насыщенный раствор сернокислого аммония. 85г соли растворяют в 100мл воды при кипячении, полученный раствор выдерживают 48 часов при комнатной температуре и фильтруют. Реакция раствора нейтральная (рН 7,0-7,1).

Ход исследования. В одну пробирку (опыт) вносят 0,5мл ликвора и 0,5мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония. В другую пробирку (контроль) наливают 1мл дистиллированной воды. Сравнивают прозрачность содержимого опытной и контрольной пробирок на черном фоне.

Оценка результатов. Проба считается положительной, если помутнение в опытной пробирке появится в течение 3-х минут. Позднее помутнение может произойти и в нормальной спинномозговой жидкости. Результаты пробы оцениваются по системе четырех плюсов так же, как проба Панди.

Реакция позволяет отличить нормальное содержание глобулинов в ликворе от патологически увеличенного. Более достоверное представление о содержании глобулинов и их фракций дает электрофорез белков ликвора.

Глюкоза. В норме cодержание глюкозы в ликворе составляет 2,7-4,4 ммоль/л. Для определения глюкозы в ликворе используют те же методы, что и для глюкозы крови (чаще всего глюкозооксидазный, ортотолуидиновый, с помощью полосок ФАН).

Хлориды. В норме содержание хлоридов в ЦСЖ составляет 118-132 ммоль/л. При менингитах (как туберкулезных, так и гнойных) количество глюкозы и хлоридов в ЦСЖ падает.

Дата добавления: 2014-11-29