Иммуноблотинг (вестерн-блот)

Является фактически конечным верификационным методом в цепи серологических исследований, позволяющих сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности пациента или же отвергнуть таковую. Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза заранее перенесены белки ВИЧ в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела испытываемых сывороток взаимодействуют с белками определенных зонах полоски. Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски (стрипа) конъюгатом и хромоген-субстратом с отмыванием не связавшихся компонентов и прекращением реакции дистиллированной водой.

Предварительное электрофоретическое разделение белков и их фиксацияна нитроцеллюлозе позволяет идентифицировать антитела к конкретным белкам в соответствии с наличием (или отсутствием) окрашивания (серовато-голубого) соответствующих зон полоски. Иммуноблотинг не может использоваться для массового скрининг исследования вследствие высокой стоимости и является методом индивидуального арбитража на заключительном этапе серологического исследования.

Существует достаточно четкие корреляции между результатами исследования сывороток в ИБ и ИФА. Дважды положительные в ИФА (в разных тест-системах) сыворотки интерпретируются затем в ИБ как ВИЧ-позитивные в 97-98% случаев. Сыворотки, положительные в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-системах, оказываются ВИЧ-позитивными в ИБ не чаще, чем в 4% случаев. При проведении подтверждающих исследований около 5% ИБ могут давать так называемые "неопределенные" результаты, которым, как правило, соответствуют положительные ИФА, но не РИП. Примерно в 20% случаев "неопределенные" ИБ вызывают антитела к gag- белкам ВИЧ-1 (p55, p25, p18). Однако есть данные о связи неспецифической реактивности с присутствием в сыворотке антител только к белку gp160 или gp41. В последнем случае обычно наблюдается одна четкая полоса в области gp41 вместо обычной для этого белка многополосной зоны окрашивания.

Наличие в сывортоке антител только к gag-белкам ВИЧ-1 всегда является поводом для дополнительного обследования пациента на инфицирование ВИЧ-2. Положительным результатом считается выявление не менее 2 (из 3-х возможных) env-полос, при наличии или отсутствии любых полос, соответствующих gag- и (или) pol-белкам. Отрицательному результату соответствует полное отсутствие полос. Другие профили принято относить к неопределенным результатам.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ПЦР выявляет предварительно усиленные (умноженные) нуклеотидные последовательности специфичные для генома данного возбудителя. Широко используется в исследовании ВИЧ для решения проблем, требующих детекции геномного материала вируса в организме in vitro и в окружающей среде. Во всех случаях из тотального препарата клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными "зондами" получают

достаточное для анализа количество провирусной ДНК. Последнюю выявляют и характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических для вируса аминокислотных последовательностей. Метод имеет множество модификаций для поиска геномного материала ВИЧ непосредственно в сыворотке крови. Можно использовать для быстрого ВИЧ-скрининга образцов крови по наличию или отсутствию в сыворотке ДНК-геномных последовательностей этого вируса.

Дата добавления: 2014-12-24