Особенности репродукции фагов с однонитевой ДНК

Представителями бактериофагов являются 2 типа бактериальных вирусов, которые имеют кольцевые однонитевые молекулы ДНК в качестве геномных нуклеиновых кислот.

1 тип: Фаг φХ174 и S-13 характеризуются сферической формой (кубический тип симметрии их вирионов).

2 тип: М13, F1, Fd являются нитевидными или палочковидными фагами и содержат однонитевую ДНК. Нитевидные фаги высвобождаются из инфицированных клеток хозяина не в результате лизиса, а путём выталкивания через поверхностные структуры во внешнюю среду без существенных повреждений клетки. Такое явление – необычно для бактериальных вирусов, т.к. большинство высвобождается путём лизиса клетки.

Фаг φх-174 был первым фагом, у которого была полностью определена нуклеотидная последовательность генома. Затем последовали близкие ему фаги F1, М13 и т.д.. Эти фаги, оба типа фагов, устроены относительно просто и характеризуются геномами не очень большой генетической ёмкостью, (максимальный геном – 9-11 генов, чаще меньше). В некоторых ситуациях суммарные белковые продукты генов данных фагов по массе превышает теоретически ожидаемые количества белков, рассчитанных на основании протяжённости генома. Такая ситуация заставила предположить, что гены данных бактериальных вирусов перекрываются ( 17-28а лекц 4), что и было продемонстрировано, тем самым генетическая ёмкость геномов этих вирусов увеличивается.

Репродукция фагов, содержащих однонитевую ДНК, на примере фага j10174. Отличие этого фага, как вы слышали, в первую очередь заключается в том, что у него затравка ставится праймазой с участием дополнительных белков клетки хозяина, контролируемые генами Dna B и Dna C. Кроме того, белок mPrim обеспечивает генерирование энерги и для постановки праймера. Праймер ставится в направлении от 3' к 5', а репликация идет от 5’ к 3'. Другие фаги этой группы ставят праймер с использованием либо ДНК-полимеразы клетки, либо чисто праймазы без участия других клеточных белков. При репликации фаговой ДНК выделяют несколько стадий:

На первой стадии формируют репликативные формы, которые реплицируются, как обычно осуществляется вегетативная репликация по тэта-типу с образованием пары десятков копий двунитевых молекул, а на завершающих стадиях, как предполагают, репликация осуществляется по типу катящегося кольца с образованием геномных однонитевых плю с -ДНК, идущих на построение фаговых частиц в качестве геномных молекул ДНК. Механизмы формирования геномных фаговых ДНК у j10174, не совсем четко представляются, хотя основные моменты известны, как полагают, достаточно подробно.

Вот на этой схеме (рис.10-24,л.7) представлены типы репликации геномных ДНК j10174. Репликативная форма 1- это двунитевая молекула ДНК суперспирализованная, закрытая, ковалентно замкнутая форма и Репликативная форма 2 - тоже двунитевая кольцевая молекула, но открытая с однонитевым разрывом, который вводит белок А, (откуда берётся белок А и когда он успевает синтезироваться и за счёт каких систем) структура которого детерминируется геномом фага. Белок А делает надрез в «+ нити», в определенном сайте, обнажая затравочный конец 3' конца нити ДНК, к которому, естественно, полимераза ІІІ клетки хозяина подставляет нуклеотиды в соответствии с матрицей синтезированной «– нить» к репликативной форме. Белок А ковалентно связывается с 5’ концом «+нити», в процессе также участвует белок reр, детерминируемый генами клетки хозяина, белок связывающийся с однонитевой ДНК и стабилизирующий эту однонитевую молекулу, а также аденозинтрифосфат, как источник энергии необходимый для осуществления процессов. При движении репликативной вилки, которая вытесняется синтезируемой копией «+нити» путем присоединения нуклеотидов к 3’-ОН концу, образующаяся нитевидная структура, покрывается белком SSВ, а reр-белок вместе с белком А находятся на ведущем конце формирующейся однонитевой молекулы ДНК. По завершению цикла образования однонитевой кольцевой молекулы, белок А отрезает образовавшуюся молекулу «+нити», покрытую белком SSB и присоединяется к новому сайту двунитевой структуры (двунитевой репликативной формы), но в этом процессе, как вы видите, участвует и лигаза, и гираза, полимераза І и новая затравка, для того, чтобы синтезировать новую нить. Если есть, то репликация возвращается ….(16:30),если же в ходе формирования однонитевой молекулы «+нити» ДНК, идущая в фаговую частицу, то раунд повторяется с этой репликативной формой 2, формируется новое кольцо, таким образом синтезируется достаточное количество геномных «+нитей» ДНК фага j10174, которые идут в состав формирующихся фаговых частиц.

Вот на этой картинке (рис.8-10, л.7) показана упрощенная репродукция фага j10174, как представителя фагов, содержащих однонитевую ДНК. Фаг прикрепляется к рибополисахаридному рецептору, располагающемуся во внешней мембране, вблизи реплисомы клетки хозяина, структуры, которая в норме прикрепляется также к реплицирующейся хромосомы клетки-хозяина, в этом процессе участвует фаговая ДНК плюс белок-лоцман. В этом месте синтезируется репликативная форма, которая удваивается по типу тэта- репликации, как я вам говорил, до двух десятков копий, а затем по этому указанному принципу формируются однонитевые «+нити» кольцевые молекулы ДНК, включающиеся в созревающие фаговые частицы. На завершающих стадиях синтезируются структурные фаговые белки и белок, вызывающий лизис клетки, который детерминируется геном фага, геном Е. Формирующиеся геномные фаговые ДНК «+нить» являются своим родом характеризующим центром, на котором собираются структурные белки фаговых частиц.

Синтез биологически активной ДНК фага φx174 «in vitro».

Эксперимент синтеза биологически активной фаговой нуклеиновой кислоты фага φx174, эксперимент Гоулеана, Корнберга и Синсхаймера 1961г. (рис.9.10, л3). Выделялась нуклеиновая кислота фага φx174, меченая по тритию, вводилась в систему Корнберга, содержащую ДНК-полимеразу, затравку, ДНК-лигазу, 4 нуклеотида, тимидиловый был заменен на бромурацильный (бромурацил меченый по фосфору). В этой системе синтезировалась репликативная форма двунитевая молекула, состоящая из исходной кольцевой молекулы плюс-нити и вновь синтезированной минус-нити. ДНК-лигаза добавлялась, чтобы бреши склеить. Затем добавлялась ДНК-аза, которая резала одну из нитей. Затем репликативная форма подвергалась тепловой денатурации. При этом возникали кольцевые минус-нити, искусственно синтезированные, тяжелые и радиоактивные, цельные плюс-нити, тоже радиоактивные и однонитевые молекулы. Это подвергалось центрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия, выделялись тяжелые кольцевые молекулы ДНК, минус-нити синтезированные на первом этапе. Эти минус-нити вводились в систему Корнберга, где уже 5-бромурацил не добавлялся, получалась также репликативная форма двунитевая. ДНКаза резала одну из нитей, получалась смесь, но выделялись не тяжелые молекулы, а легкие, синтезированные на искусственно полученной ранее матрице. Эти легкие плюс-нити использовались для заражения сферопластов кишечной палочки. В таких инфицированных сферопластах репродуцировался полноценный фаг φx174. Конечно, эффективность заражения была довольно низкой. Но дело не в том, сколько там получилось фага, а в том, что фаг получился. В дальнейшем Карана синтезировал полный геном без всяких ухищрений подобного рода, фага φx174.

Дата добавления: 2014-12-24