Механизм переключения циклов развития фага лямбда

Развитие фага λ по литическому пути определяется в значительной степени внешними условиями в которых находится клетка, взаимодействующая с фагом λ.. При обеспеченности достаточным количеством питательный веществ, при активном метаболизме клетки, как правило фаг λ развивается по литическому пути. В случае бедных условий: дефицит питания, имеет место лизогенизация, с чем это связано попробуем разобраться чуть-чуть попозже.

Развитие фага λ по лизогенному пути в значительной степени определяется экспрессией гена обозначаемого как С 2. C1-ген детерминирующий структуру репрессора фага λ, C2 тоже регуляторный ген, его белок важен для транскрипции с промотора устанавливающего лизогенное состояние P_RE-промотoр и промотор-P_i, который обеспечивает транскрипцию генов интегразы и эксцизионазы.

Промотор установления лизогенного состояния - P_RE, способствует в первую очередь транскрипции гена С1, определяющего уровень репрессора в клетке, а следовательно ингибирования возможности перехода на литический цикл. Кроме того, продукт гена-С1 репрессор фага λ, стимулирует транскрипцию промотора- P_RM, промотора обеспечивающего поддержание лизогенного состояния клетки.

(Рис 0005)

С известной долей вероятности можно утверждать, что системы переключения с одного типа внутриклеточного развития фага λ на другой, т.е. с литического на лизогенный и наоборот, зависит от двух альтернативных состояний этой системы. Первое состояние, которое обеспечивает лизогенизацию клетки хозяина, заключается в том что, ген - репрессор включен, т.е. транскрибируются гены репрессора, который ингибирует транскрипцию остальных генов. В результате этого, второй репрессор белок cro не синтезируется. Второе состояние, которое проявляет развитие фага по литическому циклу, заключается в том что, наоборот ген cro экспрессируется, а ген С1, ген репрессора фага λ, не экспрессируется. Это основные моменты, которые обеспечивают сам процесс лизогенизации или лизиса клеток.

(Рис 3.10) Гены С1 и cro, кодирующие соответственно репрессор фага λ и репрессор второго типа располагаются в хромосоме по соседству и транскрибируются в противоположных направлениях. Оба указанных белка являются димерами т.е. репрессор фага λ активен в димерном состоянии, также как и продукт гена cro. Регулируется синтез этих продуктов в промоторах, правого и левого основных промоторов, в результате взаимодействия РНК-полимеразы с соответствующими операторными сайтами. Тогда возникает вопрос – каким же образом эти белки обуславливают различные биологические функции? Как пишут, ответ заключается в сложности организации операторных областей в структуре операторов.

Вот на рисунке 1.4. показана структура О_R области, т.е. правого оператора. Этот оператор подразделен на 3 области O_R1, O_R2, O_R3. Эти области по 17 нуклеотидов очень сходны, но не идентичны и это обеспечивает легкое распознавание данных областей соответствующими регуляторными белками. Области перекрываются, соседние области - or1 с or2, or2 с or3 и в этих участках располагаются промоторы – P_R, промотор правый, и P_RM, поддерживающий состояние лизогении. С этими операторами, взаимодействует РНК-полимераза клетки, которая обеспечивает транскрипцию генов. Транскрипция осуществляется в противоположных направлениях. Ген С1 и ген cro располагаются по соседству друг с другом, но транскрибируются в противоположных направлениях. При транскрипции влево формируется репрессор и имеет место превалирование ситуации приводящей к лизогенизации, ситуации когда подавляются экспрессия всех генов кроме гена С1. Если транскрибируется ген cro то как раз активируется транскрипция всех остальных генов и не транскрибируется ген С1.

За счет чего же происходит избирательная транскрипция? С этими участками or1, or2, or3 взаимодействуют оба репрессора и репрессор С1, белок, и репрессор cro, продукт гена cro, но взаимодействие характеризуется разными аффинитетами регуляторного белка к областям промотора. Репрессор фага λ в димерном состоянии характеризуется повышенным аффинитетом к области or1, не имея выраженного аффинитета к области or2 и совсем низкий аффинитет - к области or3. При наличии достаточного количества репрессора происходят взаимодействия в димерном состоянии, взаимодействия с or1 сначала, затем с or2, формируется комплекс двух димеров на данных областях оператора, что увеличивает стабильность взаимодействия репрессора с ДНК и возможность взаимодействия РНК-полимеразы с or3 областью, по сути дела это и будет промотор RM – обеспечивающий поддержание лизогенного состояния. Транскрипция идет в левом направлении синтезируется репрессор, в определенных количествах, и транскрибируются гены, участвующие в лизогенизации. При избыточных количествах репрессора молекулы репрессора связываются с or3 и выключается транскрипция самого гена С1 т.е. имеет место ауторепрессия. Это необходимо, для того чтобы не было большого количества репрессоров в клетке, когда достаточно уже определенного уровня. Второй репрессор – продукт гена cro тоже в виде димера активен, его молекулы меньше чем молекулы С1 и взаимодействуют они с теми же самыми областями or оператора, но с противоположным аффинитетом. Наиболее выраженный аффинитет белка cro в отношении or3, в меньшей к or2, еще в меньшей к or1. Если в клетке достаточное количество cro белка то при взаимодействии с or3 этих репрессоров, выключается промотор P_RM и РНК-полимераза имеет возможность взаимодействовать с областями or2 и or1 и транскрипция идет в правом направлении транскрибируется ген cro и все остальные гены, участвующие в литическом цикле. При избытке тоже этого продукта имеет место самоподавление экспрессии гена cro. В зависимости от того, с какими областями взаимодействует промотор, регуляторные белки, имеет место тот или иной эффект, в смысле репродукции. На этой картинке показано если есть репрессор транскрибируется С1 ген то он блокирует PR промотор, ген cro не транскрибируется. РНК-полимераза транскрибирует ген С1 и располагающиеся дальше гены, однако при избытке репрессора блокируется и левый промотор и правый промотор. Таким образом, транскрибируется только ген С1, все остальные гены не экспрессируются за счет того, что репрессор инактивирует оба оператора, промоторы не функционируют. Функционирует промотор RM. Тут такая же картинка. Вот еще одна картинка.(Рис 0008, 0009)

15. Техника определения размеров вирусных частиц.

Подсчёт количества вирусных частиц осуществляется наиболее часто с использованием электронного микроскопа. Когда готовятся препараты, представляющие собой смесь полистерольных шариков известных концентраций, смешиваются с вирусным материалом (суспензии) полученной при заражении животных, растений. В случае бактерий просто: там подсчитываются бляшки и на основании количества бляшек делается заключение о количестве активных бактериофаговых частиц. Так вот смесь полистерольных шариков с вирусами используется для приготовления препаратов для электронной микроскопии, на специальных сеточках, подложках наносится плёнка и анализируется в электронный микроскоп. Подсчитывается в поле зрения микроскопа количество полистерольных шариков и количество обнаруженных вирусных частиц. И зная концентрацию шариков и сопоставляя с обнаруженными количествами вирусных частиц, можно говорить, что в таком-то определённом объёме данной суспензии вирусов содержится такое то количество вирусных частиц. Естественно этот метод не совсем точный, но удобный и широко используется для количественных оценок тех или иных вирусов.

Кроме того, количество вирусов характеризуется по инфекционной дозе. Наименьшее количество вирусной суспензии которая может вызвать заражение животных, растений с явными проявлениями клинической картины заражения. Определение размеров вирусов аналогично с подсчётом. Используются тоже полистерольные шарики известных размеров и известного диаметра. Они смешиваются и при электронной микроскопии сравниваются размеры. Делается снимок, и зная диаметр этих шариков можно вычислит размер выявляемых вирусных частиц. Кроме этого могут использоваться милипористые фильтры, нитроцеллюлозные с известным диаметром пор, через которые могут проходить вирусы с определённым размером. Этот метод менее чёткий. Можно определять размеры на основании константы седиментации.

Дата добавления: 2014-12-24