Детекция результатов реакции

Выделение нуклеиновых кислот из биологического материала

Взятие образцов

Протокол исследования

ПЦР в диагностической лаборатории является достаточно сложной, многосту­пенчатой методикой, требующей правильного выполнения всех процедур. Ниже изложены основные специфические требования к процессам взятия образцов, выделения наследственного материала, выполнения амплификации и регистрации результатов, т.е. преаналитической, аналитической и постаналитической стадии исследования.

Клиническим материалом для исследования методом ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спин­номозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты. Однако в большинстве анализов в качестве образца используют соскоб эпителиальных клеток и сыворотку крови пациента. К особенностям метода сле­дует отнести то, что материал, необходимый для исследования, должен потенци­ально содержать искомую ДНК (например, в абсолютном большинстве случаев невозможно детектировать в крови микроорганизм Chlamydiatrachomatis, так как это внутриклеточный паразит эпителиальных клеток урогенитального тракта).

В зависимости от поставленных задач используют различные методики для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. Суть методик заключается в экстракции из исследуемого образца нуклеиновых кислот и нейтра­лизации ингибиторов ПЦР.

В настоящее время существуют экспресс-методики выделения ДНК, позво­ляющие за сравнительно небольшое время обрабатывать много образцов с мини­мальными трудозатратами. Если перед лабораторией стоит задача получить более чистый препарат ДНК или детектировать низкокопийный образец, существуют методики, позволяющие провести очистку с высокой чистотой, но требующие больших трудозатрат.

Амплификация (умножение специфических фрагментов ДНК)

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.

Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении реакции («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). Классическая ПЦР предполагает анализ результатов реакции по «конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГИФА), флюоресцентную детекцию после ПЦР (FLASH) и др. Различные методы детекции результатов ПЦР имеют свои преимущества и недостатки, и, как правило, их выбирают в зависимости от задач, решаемых лабораторией. Для выявления количества ДНК в исходной пробе и наблюдения за кинетикой процес­са в современных лабораториях используют метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

Дата добавления: 2014-12-25