Ошибки и проблемы в тонкослойной хроматографии

Количественный анализ

В области количественного анализа ТСХ может дать ответ только на вопрос: “Не превышает ли содержание примеси определенный уровень”. При применении денситометров этот вопрос можно сконкретизировать до “Сколько содержится данного вещества в смеси?”, но только в том случае, если имеется калибровка по определяемому веществу. Однако, относительная погрешность измерения в этом случае достаточно велика. Достоверность анализа по системе “не больше” в силу этого превышает достоверность по системе “сколько”. Кроме того, применение качественных денситометров значительно удорожает процесс. Для определение количественного состава смеси использование жидкостного хроматографа предпочтительнее.

При ответе на первый вопрос (“не превышает ли…?”) на хроматограмму наносят строго определенное количество анализируемого вещества, рядом – одно или несколько пятен обнаруживаемой примеси с разным ее содержанием (свидетели). После элюирования пластинки пятна проявляют подходящим образом и сравнивают интенсиность окраски и площадь пятна с этими же параметрами свидетелей. Если для анализируемого вещества имеется НТД, строго регламентирующая содержание примеси на определенном уровне, то используют только один свидетель с заданным содержанием примеси. В этом случае положительный (соответствует) или отрицательный (не соответствует) результат анализа определяется по тому, превышает или не превышает по совокупности площади и интенсивности окраски пятно примеси пятно свидетеля. При этом наиболее надежный (достоверный) результат получается в том случае, если количество анализируемого образца подобрано таким образом, чтобы в нем примесь содержалась на границе обнаружения, а в свидетеле – пятно было четко различимым и надежно определяемым. Так, например, в амиксине регламентируется содержание 2-[2–(диэтиламино)этокси]флуоренона-9 – “не более 0.1 %”. Чувствительность обнаружения этой примеси составляет 0.05 мкг. Тогда, при нанесении 200 мкг амиксина и 0.2 мкг 2-[2–(диэтиламино)этокси]флуоренона-9 (0.1 % основного вещества и в 4 раза боьше предела обнаружения) и наличии на хроматограмме слабо различимого пятна примеси при четком пятне свидетеля, можно с высокой степенью достоверности утверждать, что содержание этой примеси в амиксине меньше заданного предела.

Наиболее распространенными ошибками с которыми может сталкиваться исследователь при проведении хроматографического анализа являются следующие:

“ложно-отрицательные” – на основании совпадений R_f анализируемого вещества и вещества сравнения делается ошибочный вывод об их идентичности, или вывод об отсутствии примеси в анализируемом образце делается на основании наблюдения единственного;

“ложно-положительные” – наличие двух пятен на хроматограмме пробы принимается за наличие примеси в анализируемом веществе;

“реакция прошла” – на основании наличия на хроматограмме реакционной смеси пятна, характерного для продукта реакции, при отсутствии пятна, характерного для исходного(ых) вещества, делается вывод об ее прохождении.

6.1 “Ложно-отрицательные” ошибки в ТСХ

Ошибки первого типа могут возникать из-за совпадения значений Rf двух разных веществ в выбранных условиях хроматографического анализа. В большинстве случаев эта ошибка преодолевается использованием для анализа нескольких разных сочетаний сорбент-элюент. Наиболее типичной причиной возникновения ошибок в этом случае является использование в элюенте растворителей сильно различающимися значениями элюотропных параметров (бензол – метанол, гексан – ацетон, бензол – хлороформ – метанол – вода). В этом случае оба вещества практически не элюируются более “легким” компонентом элюента (с меньшим значением элюотропного параметра). По мере элюирования к точке нанесения подходит b-фронт, в котором скачкообразно нарастает концентрация более “тяжелого” компонента. Если в этом элюенте для обоих веществ Rf близко к 1, то возникает впечатление идентичности анализируемых образцов. Характерной особенностью, по которой можно заподозрить наличие такого рода ошибки является то, что эти пятна “висят” непосредственно под b-фронтом, или “лежат” непосредственно на нем.

Однако, если вещество и примесь могут образовывать устойчивый межмолекулярный комплекс (этот комплекс должен быть по крайней мере более выгоден чем адсорбция каждого из компонентов на сорбенте), который хроматографируется как отдельное вещество. Разрешение ошибки в этом случае может быть достигнуто применением реагентов, избирательно реагирующих с одним из участников этого комплекса. Простейшим способом является введение в точку нанесения сильной кислоты или основания, или добавление приемлемых кислот или оснований в состав элюента.

Так было обнаружено, что смесь азлактона и исходного для его получения альдегида хроматографируется как одно вещество, давая единственное пятно на хроматограмме. Введение в анализируемую пробу этой смеси ацетата фенилгидразина приводит к появлению на хроматограмме двух дополнительных пятен, а не одного, как можно было ожидать. При этом Rf азлактона увеличивается с 0.5 до 0.65. Аналогично, смесь бензанилида, бензойной кислоты и анилина, образующейся при синтезе бензанилида по Эйнгорну хроматографируется как единственное вещество, причем, анилин по реакции с нингидрином на пластинке в пятне не обнаруживается. После обработки этой смеси раствором карбоната натрия остаток, не растворенный в воде, дает уже два пятна – анилида и анилина, а на хроматограмме водной вытяжки после обработке ее кислотой обнаруживается единственное пятно, соответствующее бензойной кислоте.

6.2 “Ложно-положительные” ошибки в ТСХ

Ошибки второго типа могут возникать если вещество модифицируется в умеренной степени в процессе анализа непосредственно на пластинке, причем, такая модификация может быть как обратимой, так и необратимой. Наиболее ярким примером обратимой модификации анализируемого вещества является наличие “загадочной” примеси в амиксине при анализе его на пластинках Silufol с применением элюента состава бензол – хлороформ – этанол – водный аммиак (5:3.5:1.5:0.5). В этих условиях непосредственно под пятном амиксина (разница Rf 0.05 – 0.1) наблюдается слабоокрашенное пятно, которое не удавалось сопоставить ни с одной из возможных (исходя из технологии получения) примесей. Этот элюент отличался неустойчивостью и в ряде случаев расслаивался. В связи с этим, водный аммиак, использовавшийся при его приготовлении, был заменен таким же объемом насыщенного раствора аммиака в этаноле. В этом случае “загадочное” пятно оказывалось еще более интенсивным. Все попытки “очистить” амиксин от этой “примеси” оказались безуспешными. Для установления характера этой примеси было проведено препаративное разделение 7 г “загрязненного” амиксина на 120 пластинкахс толщиной слоя 2 – 5 мм. Амиксин и загадочная “примесь” четко разделялись на пластинках, причем, между их зонами оставалось полоса чистого сорбента приблизительно полуторасантиметровой ширины. Эвакуацией зон амиксина и “примеси” с последующей элюцией их с сорбента было выделено 6.5 г “чистого” амиксина и 0.5 г “примеси”. И хроматографический и масс-спектральный анализ показали полную идентичность амиксина и “примеси”. Анализ особенностей химической структуры амиксина и возможных его реакций с компонентами элюента привел к предположению о возможности обратимого присоединения аммиака к карбонильной группе амиксина.

Образующийся при этом a-гидроксиамин стабилизируется взаимодействием кислорода гидроксильной группы с сорбентом. При удалении этого вещества с сорбента и упаривании его раствора равновесие смещается в сторону образования амиксина и аммиака, который удаляется вместе с растворителем. Справедливость этого предположения подтверждается тем, что замена аммиака третичным амином привела к заметному “уменьшению” содержания “примеси”. В результате ряда экспериментов было установлено, что наиболее надежные результаты хроматографического анализа амиксина получаются при применении в качестве элюента смеси бензола с триэтиламином и метанолом в соотношениях 10:1:0.1. Незначительные количества метанола в этом элюенте служат для предотвращения образования аддукта амиксина с триэтиламином, который, хотя и образуется в гараздо меньших количествах, чем с применением аммиака, регистрируется под УФ-облучением.

В качестве примера необратимой модификации анализируемого вещества в процессе хроматографирования можно привести диспропорционирование гидразона амиксина до соответствующего азина и гидразина (образование гидразина гипотетично – его не обнаруживали специально) при хроматографировании на силикагеле и образование флуоренона и азота (предположительно) при хроматографировании на окиси алюминия.

Ошибки этого типа уверенно разрешаются двумерной хроматографией с применением одного и того же элюента в обоих направлениях. Образование на двумерной хроматограмме “квадрата” (4 пятна, расположенных по углам прямоугольника) свидетельствует о наличии обратимой модификации. Образование “треугольника” (3 пятна, образующих вершины прямоугольного треугольника) свидельствуют о необратимой модификации. Образование “диагонали” (2 пятна, расположенных на прямой, приблизительно совпадающей с диагональю пластинки) свидетельствуют об отсутствии трансформации анализируемого вещества в процессе хроматографирования и однозначно указывают на наличие реальной примеси.

В ряде случаев вещество претерпевает трансформацию на поверхности сорбента не в процессе элюции, а при выдерживании пластинки на воздухе (в отсутствии органического растворителя). Так было замечено, что арилакридинилгидразины в виде свободных оснований на поверхности силикагеля весьма быстро (в 20 – 100 раз быстрее, чем в растворе) окисляются до 9-арилазоакридинов.

Эфиры акридиниламинокислот подвергаются гидролизу адсорбированной водой на поверхности силикагеля до соответствующих кислот, причем, скорость гидролиза значительно зависила от строения аминокислоты.

Эти примеры показывают, что время между нанесением образца на пластинку и элюцией может также являться источником ошибок. Если для проявления хроматограммы используется обработка специфическими реактивами, то существенным может оказаться и время между окончанием элюции и проявлением хроматограммы.

Дата добавления: 2014-12-27