Выделение РНК из печени животных

Животные.

Биологические методы.

Для исследования биологических эффектов полученных механокомпозитов в печени животных использовали мышей линии Balb/c массой 20 г (лаборатория разведения животных Института клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск). Животные содержались при комнатной температуре, естественном освещении и получали стандартную лабораторную диету и воду ad libitum. Исследования механокомпозитов и исходного растительного сырья разных образцов были разделенны по времени. Сначала проведены исследования в группах 1-5, а затем 6-10. Животные были разделены на 10 групп, содержавшихся в отдельных клетках, по 3 животных в каждой группе.

Группа №1 – контроль.

Группа №2 – механокомпозит травы зверобоя с щелочью.

Группа №3 – исходная трава зверобоя.

Группа №4 – механокомпозит зеленого чая с адипиновой кислотой.

Группа №5 – исходный зеленый чай.

Группа №6 – контроль (второй).

Группа №7 – исходная лузга риса.

Группа №8 – механокомпозит лузги риса с зеленым чаем.

Группа №9 – исходная неплодовая часть облепихи.

Группа №10 – механокомпозит неплодовых частей облепихи с аскорбиновой кислотой.

Образцы экспериментальным животным вводили зондом per os в 100 мкл 1% крахмального геля в дозе 100 мг/кг в течение трех дней.

Забой мышей осуществлялся через 14 часов после последнего введения препарата, путем дислокации шейных позвонков. Брюшную полость быстро вскрывали, от правой доли печени забирали примерно 50 мг органа и помещали в жидкий азот (образцы групп 1-5), либо в RNA-later Solution (образцы групп 6-10). Полученные образцы хранились в пробирках Эппендорф до процедуры проведения выделения РНК при -70^оС не более трех суток.

Выделение РНК проводилось c помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (фирмы Qiagen). Кусочек ткани не более 30 мг помещали в пробирку Эппендорф на 1,5 мл и гомогенизировали вручную пестиком в 600 мкл RLT Plus Buffer, содержащем гуанидин-изотиоцианат и бета-меркаптэтанол. Первый является одним из самых мощных денатурантов белка и очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз [1]. Бета-меркаптэтанол инактивирует РНКазы, восстанавливая дисульфидные связи, и тем самым препятствует разрушению РНК. Затем центрифугировали полученный лизат в течение 3 минут при 13,4 g (?), отбирали 350 мкл супернатанта с помощью пипетки и переносили в gDNA Eliminator spin column, в которой происходила абсорбция геномной ДНК. Колонку, установленную в пробирку, центрифугировали 30 сек (указать величину g). Колонку выкидывали, а к собранному в пробирке раствору РНК добавляли равный объем 70% этанола. Переносили 700 мкл образца в RNeasy Spin column, в которой происходила адсорбция суммарной РНК, ставили колонку в пробирку и центрифугировали 15 сек, содержимое пробирки сливали. Затем добавляли в RNeasy Spin column 700 мкл RW1 Buffer, содержащий небольшое количество гуанидин-изотиоцианата для промывки колонки, и центрифугировали 15 сек, содержимое пробирки сливали. Затем добавляли в RNeasy Spin column 500 мкл RPE Buffer и центрифугировали 15 сек, сливали содержимое пробирки, и опять добавляли 500 мкл RPE Buffer и центрифугировали 2 мин, тем самым добиваясь полного очищения РНК от всех примесей. Переносили RNeasy Spin column в новую пробирку и центрифугировали 1 мин (ничего не добавляли?). Меняли пробирку на конечную и наносили на колонку 50 мкл свободной от РНКаз воды (RNase-free water) для десорбции суммарной РНК, центрифугировали 1 мин. Колонку выкидывали, а Эппендорф с выделенной РНК хранили при -20^оС до процедуры обратной транскрипции.

Дата добавления: 2015-04-25