Критерии чистоты мембранных фракций

Разделение мембран

В настоящее время для разделения мембран чаще всего применяют центрифугирование. Мембранные частицы можно разделить по скорости их седиментации или по плавучей плотности. Первый метод называется зональным центрифугированием, и разделение происходит в соответствии со значениями S, а второй - изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. На практике обычно применяют некий гибрид этих двух методов. На рис.1.7 показано положение некоторых субклеточных единиц на координантной плоскости "S-g".

По оси абсцисс отложены коэффициенты седиментации частиц, а по оси ординат - плотность.

Принцип разделения по скорости седиментации можно легко уяснить, сравнив значения S для разных фракций. Например, ядра имеют относительно высокие значения S, т.е. скорость их седиментации значительно выше, чем у большинства других субклеточных органелл. Ядра можно избирательно осадить центрифугированием клеточного гомогената, при этом все другие органеллы останутся в надосадочной жидкости. В то же время гладкий и шероховатый эндоплазматический ретикулум не удается разделить с помощью зонального центрифугирования.

Для выделения различных мембранных фракций из клеточного гомогената часто используют различия в их плотности. С этой целью проводят центрифугирование в градиенте плотности. Чаще всего для создания градиента плотности используют сахарозу, однако этот метод имеет серьезные недостатки. Чтобы получить плотность, требуемую для разделения различных мембранных фракций, необходимо готовить растворы с высокой концентрацией сахарозы, которые обладают высокой вязкостью и к тому же являются гипертоничными. Внесение субклеточных органелл в гипертоничный раствор сахарозы приводит к их дегидратации, а последующее доведение раствора до изотонических условий часто сопровождается лизисом и повреждением органелл. Другая проблема состоит в том, что многие мембранные органеллы проницаемы для сахарозы. Это также может привести к осмотическому разрушению органелл. Проникновение сахарозы в разделяемые мембранные органеллы может изменить их эффективную плотность.

Таблица 1.1. Физические время все чаще используют другие среды для создания градиента плотности. Некоторые из этих сред перечислены в табл.1.1

	Концентрация,	Плотность,	Вязкость,	Осмоляльность,
	% (в/о)	г/мл	сП	мОсм/кг НгО
Сахароза		1,06
Метризамид		1,16

Чтобы решить эти проблемы, в последнее свойства градиентных сред.

1. Фиколл. Высокомолекулярный гидрофильный полимер сахарозы, который можно использовать для получения растворов С'Плотностью вплоть до 1,2 г/мл. Основное его преимущество состоит в низком осмотическом давлении растворов по сравнению с растворами с эквивалентной концентрацией сахарозы. Благодаря этому можно создавать растворы, изотоничные во всем диапазоне концентраций благодаря дополнительному включению в среду сахарозы или приемлемых с физиологической точки зрения солей. Недостатками являются высокая вязкость получаемых растворов и существенно нелинейная зависимость вязкости и осмолярности от концентрации.

2. Метризамид. Трииодзамещенный бензамид глюкозы Растворы метризамида имеют большую плотность, чем расторы фиколла при тех же концентрациях. Основным преимуществом растворов метризамида является их очень низкая вязкость, что позволяет ускорить разделение.35% -ный раствор метризамида имеет почти физиологическую осмолярность, так что большую часть операций в ходе разделения мембран можно проводить, не подвергая их действию гипертоничных растворов. Метризоат натрия - родственное метризамиду соединение с близкими свойствами, с тем лишь отличием, что его раствор является изотоничным при концентрации около 20%. Метризоат натрия ис- пользуют прежде всего для выделения интактных клеток. Найкоденз также является производным трииодбензойной кислоты, но имеет три гидрофильные боковые цепи. При центрифугировании он быстро образует свой собственный градиент плотности; используется для выделения субклеточных органелл.

Перколл. Коллоидная суспензия силикагеля, частички которого покрыты поливинилпирролидоном. Это покрытие ослабляет токсическое влияние силикагеля. Основным преимуществом перколла является то, что он не проникает через биологические мембраны, а его растворы имеют низкую вязкость и низкую осмолярность. Вследствие большого размера частиц центрифугирование раствора перколла при умеренных скоростях приводит к формированию градиента плотности. Поэтому разделение обычно происходит очень быстро. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотоничной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Не составляет труда создать пологий градиент, что позволяет проводить весьма эффективное разделение мембранных фракций по их плавучей плотности.

Сорбитол и маннитол. Эти вещества иногда используют вместо сахарозы, поскольку они, судя по опубликованным данным, проникают через некоторые биологические мембраны хуже, чем сахароза.

Заметим, что глицерол не используется для создания градиента плотности, поскольку с его помощью не удается достичь достаточно высоких значений плотности. Соли щелочных металлов, например CsCl, используют только тогда, когда необходимы растворы с высокой плотностью. Но при этом следует иметь в виду, что в концентрациях, требуемых для создания равновесной плотности, эти соли часто оказывают повреждающее действие на мембранные органеллы.

Для выделения мембран из клеточных гомогенатов используются и другие методы, хотя и не так часто, как центрифугирование.

1. Фазовое распределение. В этом случае разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их поверхностными свойствами. С этой целью формируют два несмешивающихся слоя водных растворов различных водорастворимых полимеров. В качестве примера можно привести смеси полиэтиленгликольдекстран и декстранфиколл. Мембранные частицы разделяются в соответствии с их сродством к этим фазам. Последние можно подбирать так, чтобы разделять мембраны по их поверхностному заряду или гидрофобности.

Непрерывный электрофорез в свободном потоке. В этом случае разделение частиц происходит в соответствии с их электрическим зарядом. Разделяемый препарат непрерывно вводят в тонкий слой буфера, стекающего по вертикальной стенке. При этом перпендикулярно направлению потока прикладывают электрическое поле. Таким образом, электрофоретическое разделение частиц происходит поперек стекающего буфера, который собирается на дне камеры в виде отдельных фракций.

Аффинная адсорбция. Разделение основано на биоспецифическом взаимодействии между мембранными компонентами и твердой фазой. С открытием моноклональных антител появилась возможность создания препаративных методик, основанных на использовании специфических антигенных компонентов для выделения мембран. Полученные антитела можно ковалентно присоединять к твердому носителю и с их помощью осуществлять специфическое связывание соответствующих мембран. Чаще всего этот метод используется для выделения мембранных белков. Одна из возникающих здесь проблем связана с подбором таких условий элюирования мембран, которые не вызывали бы денатурации белков.

Метод, основанный на использовании микрогранул силикагеля. Обычно на долю плазматических мембран приходится не более 1°7о общей массы всех мембран эукариотических клеток. Поэтому выделение абсолютно чистых плазматических мембран сопряжено с большими трудностями. Один из подходов, который разработан специально для выделения плазматических мембран, основан на использовании катионизированных микрогранул селикагеля. Эти гранулы прочно адсорбируются на наружной поверхности плазматической мембраны интактных клеток, и фракция плазматических мембран, связанных с гранулами, легко отделяется в градиенте плотности сахарозы от других мембран за счет более высокой плотности гранул. Особенностью этого метода является то, что в получаемом препарате плазматическая мембрана своей внутренней поверхностью обращена в раствор.

Пожалуй, наиболее объективным критерием чистоты выделенной мембранной фракции является присутствие в ней какого-либо уникального компонента, который содержится только в этой мембране или является в ней преобладающим. Обычно такими компонентами служат ферменты, которые в данном случае называют маркерами. Список маркерных ферментов, которые используются для контроля чистоты мембранных фракций, приведен в табл.1.2 При определении активности фермента следует принимать во внимание, что он может находиться в латентной форме, например благодаря тому, что локализуется на внутренней поверхности выделяемых мембранных везикул. Другие проблемы, связанные с оценкой чистоты выделенных мембран, рассмотрены в обзоре. Следует отметить, что рекомендуемые методы в большинстве случаев достаточно хорошо отработаны и стандартизованы.

В ряде случаев более удобными мембранными маркерами являются не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, гормонов, токсинов или антител. Если изучаемые системы хорошо охарактеризованы, то о чистоте мембранной фракции можно судить по ее белковому составу, определяемому с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Например, наружная мембрана грамотрицательных бактерий имеет характерный набор полипептидов, которых нет в цитоплазматической мембране.

Таблица 1.2 Маркеры, используемые для контроля чистоты мембранных фракций, выделяемых из клеток млекопитающих "

Мембранная фракция	Маркерный фермент
Плазматические мембраны	5 '-Нуклеотидаза
	Щелочная фосфодиэстераза
	Na */К^+-АТРаза (базолатераль-
	ная мембрана эпителиальных
	клеток)
	Аденилатциклаза (базальная
	мембрана гепатоцитов)
	Аминопептидаза (мембрана
	щеточной каемки эпителия)
Митохондрии (внутренняя	Цитохром с-оксидаза
мембрана)	Сукцинат-цитохром с-оксидо-
	редуктаза
Митохондрии (наружная	Моноаминооксидаза
мембрана)
Лизосомы	Кислая фосфатаза
	0-Галактозндаза
Пероксисомы	Каталаза
	Уратоксидаза
	Оксидаза D-аминокислот
Мембраны аппрата	Галактозилтрансфераза
Гольджи
Эндоплазматический	Глюкозо-6-фосфатаза
ретикулум	Холинфосфотрансфераза
	NADPH-цитохром с-оксидо-
	редуктаза
Цитозоль	Лактатдегидрогеназа

К другим критериям, по которым можно судить о чистоте мембран, относятся их морфология, выявляемая с помощью электронной микроскопии, и особенности химического состава. Например, фракции, представляющие плазматическую мембрану, аппарат Гольджи или митохондрии, можно идентифицировать по их морфологии. В некоторых случаях препарат характеризуют по содержанию в нем холестерола. Например, в мембранах митохондрии содержится гораздо меньше холестерола, чем в мембранах аппарата Гольджи и плазматических мембранах.

Дата добавления: 2015-04-25