Количественное определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции

Буферные свойства сыворотки крови

Работа 8. Биохимия крови

Обнаружение кровяных пигментов в моче кипячением со щелочью (проба Геллера).

Гематурия - появление в моче форменных элементов крови. Моча при гематурии окрашена в темно-красный или буро-красный цвет. Гемоглобинурия - появление свободного гемоглобина в моче в результате наступившего внутрисосудистого гемолиза. В случае гемоглобинурии моча имеет рубиново-красную окраску, эритроциты в осадке мочи отсутствуют. При кипячении со щелочью кровяные пигменты гидролизуются с отщеплением гематина, имеющего бурую окраску. Из гематина под влиянием редуцирующих веществ мочи образуется гемохромоген, окрашенный в красный цвет. Осадок фосфатов щелочноземельных металлов, выпадающий из мочи в щелочной среде, захватывает гематин и гемохромоген и окрашивается соответственно в бурый или красный цвет.

К 1 мл мочи добавляют по каплям 10% раствор гидроксида натрия до щелочной реакции. Выпадает хлопьевидный осадок фосфатов кальция и магния. Пробирке дают стоять до охлаждения содержимого. На дно оседает осадок фосфатов, окрашенный при наличии кровяных пигментов в бурый цвет (гематин) или красный (гемохромоген). В нормальной моче осадок фосфатов имеет белый или грязно-белый цвет.

Контрольные вопросы

1. Какие физиологические и патологические факторы влияют на сдвиг рН мочи в кислую или щелочную сторону?

2. При каких заболеваниях в моче присутствует белок?

3. При каких патологиях наблюдаются гематурия и гемоглобинурия?

4. Какие состояния приводят к развитию глюкозурии?

Буферные системы поддерживают рН крови на постоянном уровне, близком к 7,4. К ним относятся бикарбонатная, фосфатная, белковая и гемоглобиновая буферная система. Значение рН плазмы 7,4 определяется физиологической концентрацией в ней компонентов бикарбонатной и фосфатной буферных систем. Основным внеклеточным буфером является бикарбонатный.

В одну пробирку наливают 1 мл сыворотки, в другую - 1 мл воды. В обе пробирки прибавляют по 3-4 капли раствора индикатора бромфенолового синего и затем по каплям из бюретки 0,1 н. раствор соляной кислоты. Отмечают, какое количество кислоты пошло в том и другом случае до достижения одинакового изменения окраски.

Белки сыворотки крови при взаимодействии с сульфатом меди в щелочной среде образуют за счет своих пептидных связей комплексные соединения с ионами меди фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания раствора находится в прямой зависимости от концентрации в нем белка.

К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива. Одновременно ставят контроль. К 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия прибавляют 5 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля.

Для построения калибровочного графика из стандартного 5% раствора белка готовят рабочие стандартные растворы, как указано в таблице 8. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30-60 минут измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре против контроля. По полученным данным строят калибровочный график. Норма - 6,5-8,5% белка. При содержании белка в сыворотке больше 10% сыворотку разводят физиологическим раствором, а результаты умножают на коэффициент разведения.

Таблица 8. Состав смесей для построения калибровочного графика.

№ п/п	Стандартный раствор белка, мл	0,9% раствор хлорида натрия, мл	Содержание белка в пробе, г	Концентрация белка, %
	0,4	0,6	0,02
	0,6	0,4	0,03
	0,8	0,2	0,04
	1,0	-	0,05

Дата добавления: 2015-03-29