Электрофорез белков плазмы крови

Электорофорез белков плазмы (EPH) - распространенный диагностический метод в ветеринарии млекопитающих уже много лет. Развитие этого метода упростило процедуру анализа и сейчас требует очень небольших количеств плазмы, что позволяет использовать его в ветеринарии птиц (Cray, 2000) и рептилий (Zaias, Gray,2002).

Техника электрофореза. Основной принцип EPH включает покрытие плазмы или сыворотки тонким агарозным гелем. Прохождение электрического тока через гель заставляет мигрировать белки, в результате чего образуются полосы, зависящие от заряда и размера белковых молекул. После этого гель фиксируют, окрашивают и анализируют полосы визуально или квалифицируют с помощью лазерного сканирования в денситометре. Коммерческие системы для EPH-диагностики упрощают процесс и требуют всего 10 мкл сыворотки или плазмы. После помещения микрообразца в гель его подвергают электрофорезу в течение 40 минут при 100V, высушивают, окрашивают и сканируют в денситометре при 600 нм. Относительный и абсолютный (г/дл) размер белковых фракций можно определить на основании данных об уровне общего белка, полученных методом рефрактометрии.

Вопрос об использовании плазмы или сыворотки уже обсуждался несколькими авторами при исследовании разных видов птиц. Для птиц предпочтительнее использовать плазму. Общий белок плазмы в среднем на 1,7 г/дл, выше, чем в сыворотке из-за присутствия фибриногена. Так как фибриноген является острофазным белком, то есть индикатором острого воспаления, предпочтительнее включать эту фракцию в процесс EPH, как и при определении уровня общего белка. В остальном, сравнение результатов, полученных при EPH сыворотки или плазмы не показывает достоверных различий (Lumei and DeBruije, 1985).

Нормальные белки плазмы.

Основные фракции белков, выделенные с помощью EPH включают (слева направо) альбумин, a-1 глобулин, a-2 глобулин, β-глобулин, g-глобулин. На рис. изображена электрофоретограмма здоровой зеленой игуаны. Альбумины представляют максимальную порцию белков плазмы и являются наиболее гомогенной и различимой фракцией у здоровых млекопитающих, птиц и рептилий. Альбумины работают как транспортные белки и определяют приблизительно 75% осмотической активности плазмы. Иногда у здоровых птиц можно обнаружить преальбуминовую фракцию, но у здоровых млекопитающих она встречается редко. Предварительные результаты показывают, что преальбуминовая фракция может встречаться у некоторых видов здоровых черепах (Zaias, Gray, 2002). Значение этих белков не ясно, но скорее всего эта фракция представлена белками, близкими к альбуминам по свойствам (транспортные белки). Альфа-глобулины обычно встречаются у птиц в виде двух отдельных фракций: a-1 и a-2. Эти фракции включают белки острой фазы: a-липопротеин, a-1-антитрипсин и a-2-макроглобулин (Kaneko, 1997; Cray, 2000). Бета-глобулины являются белками острой фазы воспаления и включают фибриноген, трансферрин, бета-липопротеин и комплемент. Они могут выделяться в виде одной или двух отдельных полос или пиков на электрофоретограмме. Фракция гамма-глобулинов представлена циркулирующими иммуноглобулинами. Обычно выделяется один пик, но редко – два. Продукты деградации комплемента также могут мигрировать в эту область (Kaneko, 1997).

В добавлении к оценке белковых фракций, из этих данных можно вычислить и использовать А/Г индекс для определения соотношения альбуминов и глобулинов. У птиц в норме концентрация глобулинов минимальна по сравнению с доминирующими глобулинами. У рептилий ситуация, наверно, похожа. Применяют следующую формулу подсчета А/Г индекса: (преальбумины (если имеются) + альбумины): (a-1 + a-2 + b + g-глобулины).

Анализ и интерпретация электрофоретограммы.

Хотя нормальные значения этих фракций для рептилий пока не установлены, основы для интерпретации данных EPH можно почерпнуть из литературы о птицах и млекопитающих (Kaneko, 1997). Многие из белков плазмы, в том числе белки острой фазы и иммуноглобулины, заметно изменяются при заболевании. Фракционирование и определение индивидуальных фракций белков позволяет определить характер их повреждения. К примеру, белки острой фазы отвечают за локализацию повреждения и начало выздоровления. Концентрация многих из них повышается, что заметно по увеличению пиков альфа и бета-глобулинов, и часто это наиболее ранний симптом острого воспаления или инфекции. В дальнейшем возрастает фракция гамма-глобулинов в связи с продукцией антител к конкретному патогену.

В качетсве примера на рисунке показана электрофоретограмма от больной игуаны с симптомами слабости, анорексии, фасцикуляцией мышц и нарушением формирования скелета. Биохимия крови показывает инверсию кальция и фосфора. На электрофоретограмме заметно резкое снижение альбуминов (19% вместо 43%) и повышение бета-глобулинов (58% вместо 19%). Эти данные говорят о хронической патологии печени или почек, как потенциальной причине или наоборот, следствии метаболических расстройств. На другом рисунке изображена электрофоретограмма плазмы нескольких игуан разного возраста и общего состояния. Наши предварительные результаты показывают, что помимо увеличения фракции острофазных белков, у больных животных может отмечаться исчезновение некоторых в норме присутствующих минорных фракций.

Нарушенный А/Г индекс часто является первым симптомом диспротеинемии. Понижение этого показателя говорит о значительном повышении глобулинов, понижении альбуминов, или обоих процессах. Снижение индекса при нормальном уровне общего белка – важный симптом диспротеинемии, который без вспомогательного EPH-теста не определяется.

Изменения на электрофоретограмме охарактеризованы пока только у птиц (Cray,1999):

общий белок: Гиперпротеинемия указывает на дегидратацию; гипопротеинемия является нормой у птиц в возрасте до 8 месяцев, у взрослых это обычно указывает на гипергидратацию.

альбумины: Гиперальбуминемия редко встречается без дегидратации; гипоальбуминемия может быть обусловлена потерей почками, печенью, ЖКТ или встречается при эндопаразитарных болезнях. Пониженный синтез альбуминов отмечают при болезнях печени, истощении и при хроническом воспалении.

a1-глобулины: повышение этой фракции характерно при остром воспалении, паразитозах;

a2 – глобулины: повышение встречается при остром воспалении, гепатитах, нефритах, нефротическом синдроме.

β-глобулины: повышение обычно при остром и хроническом воспалении, гепатите, нефритах, острых и хронических хламидиозах, аспергиллезе.

g-глобулины: повышение обычно при остром воспалении, инфекционных болезнях, желточном перитоните, иммунных болезнях, опухолях ретикулоэндотелиальной системы.

Физиологические влияния (возраст, гормоны, питание, стресс), не связанные с болезнью, могут изменять показания EPH, что необходимо учитывать при интерпретации. Впрочем, у птиц и млекопитающих эти факторы сами по себе влияют на результаты EPH в значительно меньшей степени, чем болезнь. Принципы, разработанные для птиц, скорее всего, подходят и для рептилий, а для амфибий таких работ пока не было выполнено.

Как и в случае других лабораторных исследований, в результатах электрофоретограмм рептилий могут иметься значительные видоспецифические и сезонные вариации. Поэтому важно накопление первичной информации и установление стандартов для каждой конкретной лаборатории.

Дата добавления: 2015-03-29