Обезвоживание гистологического материала

Оптически прозрачные среды

Мазки и тотальные препараты. Особенности приготовления

Пример тотального препарата: участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из четырех стандартных этапов пропускаются два — уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя). Производится только фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду.

В остальных случаях приготовление гистологического препарата — весьма долгая и трудоемкая процедура. При правильном ее выполнении полученный препарат может хранится неопределенно долгое время.

Заключение срезов представляет собой помещение окрашенного среза, монтированного на предметном стекле, под покровное стекло с использованием среды для заключения, имеющий коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла — канадский бальзам, полистирол, специальные среды для заключения. Заключенный препарат можно хранить достаточно длительное количество времени (исключение — при использовании полистирола препарат постепенно теряет прозрачность, а сам полистирол трескается. Данные изменения при заключении полистиролом значительно уменьшаются если в полистирол добавить пластификатор например дибутилфталат, при таком условии срок годности гистопрепарата увеличивается до 10 лет даже без покровного стекла, в течение 3 лет изменений практически не происходит).

Полистирол

Хорошо растворимая в ксилоле и толуоле синтетическая пластмасса.

Метод приготовления: 25% раствор полистирола в ксилоле + 6% дибутилфталата. Готовую синтетическую смолу хранят в плотно закрытой посуде.

БиоМаунт

Готовая синтетическая монтирующая среда для заключения гистологических и цитологических препаратов, представляющая собой смесь акриловых смол в ксилоле.

Общие требования к средам для заключения препаратов:

-Быстро сохнет.

-Равномерное и быстрое распределение на предметном стекле.

-Не образует воздушных пузырьков.

-Не искажает преломление света по отношению к стеклу.

-Стекла не слипаются.

-При длительном хранении не трескается, не мутнеет и не меняет цвета.

-Экономичный расход

Натуральные среды:

Канадский бальзам — смола, получаемая из пихты бальзамической, растущей в Канаде. Показатель преломления 1,55 (близкий к стеклу). Не мутнеет, не кристаллизуется.

Кедровое масло — масло сосны сибирской.

После фиксации, для которой применяется формалин, кусочки промывают в течение 6, 12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по которому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают.

В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота материал следует промыть в нескольких сменах 70% спирта, после фиксации с использованием сулемы — в йодированном 70% спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакций, электронно-микроскопического и иммуноцитохимического исследований, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях.

В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70-80% спирте.

Перед заливкой материала в парафин или целлоидин его необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70%. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порций 96% и двух — 100% спирта. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 часов в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее ил салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее.

Процесс обезвоживания можно ускорить, периодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37 градусах. Спирты в батарее необходимо своевременно заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее.

Абсолютный спирт можно приготовить из 96%. Для этого применяют сульфат меди, который помещают в ступку и прокаливают на спиртовке или в термостате, периодически растирая и размешивая до консистенции пыли и бледно-голубого цвета. Затем сульфат меди (1 часть) засыпают в банку с 96% спиртом (4 или 6 частей), плотно закрывают ее крышкой, взбалтывают и оставляют на несколько дней, периодически встряхивая. Сульфат меди адсорбирует воду из спирта и вновь приобретает синюю окраску. Перед использованием абсолютного спирта проводят его контроль спиртометром или в пробирку с небольшим количеством ксилола (4-5 мл) добавляют каплю приготовленного спирта (раствор мутнеет, если спирт недостаточно обезвожен). Хорошим адсорбентом воды из спирта является также силикагель после предварительного просушивания его в термостате.

При отсутствии 100% спирта в батарею включают еще одну порцию 96% спирта. Однако в этом случае всегда есть опасность недостаточного обезвоживания и возникновения трудностей при получении срезов.

С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2-3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины объектов. Обезвоживание тканей возможно с помощью 99% изопропилового спирта, который непосредственно смешивается с парафином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в патогистологической технике.

Для обезвоживания глицерином кусочки ткани последовательно помещают в 60%, 80% и 100% глицерин на 3-4 часа, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100% глицерина и ксилола.

Выраженное влияние на скорость обезвоживания оказывает микроволновое излучение. Объекты в 70% спирте помещают на 20 с в микроволновую печь (2,5 Гц / 500 В), а затем дообезвоживают в абсолютном спирте в течение 30-60 минут.

Секционный и биопсийный материал часто обезвоживают в аппаратых типа АТ-5 и других с последующим пропитыванем толуолом, хлороформом или их смесью с парафином. При этом применяют две порции 96% спирта и две 100%. Общая продолжительность обезвоживания 48 часов. Преимущество использования аппаратов состоит в том, что в них материал постоянно перемешивается и находится во взвешенном состоянии. Однако аппарат не включается автоматически после внезапного перепада напряжения в электрической сети, что может привести к пересушиванию большого количества материала.

Дата добавления: 2015-04-30