Ориентировочная реакция агглютинации на стекле

Реакция агглютинации на предметном стекле используется для ускоренной постановки диагноза (идентификации аозбу-дитепя). Для этого на предметном стекле пастеровской пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом на том же стекле помещают каплю физиологического раствора для контроля. Петлёй снимают небольшое количество исследуемого материала бактерий (можно брать бактерии из колоний на чашке, со скошенного агара) и вносят их в каплю сыворотки; размешивают до получения равномерной мути. Второй же комочек микробной массы размешивают в капле физиологического раствора. Через несколько минут при положительной реакции агглютинации в капле с сывороткой появляются хлопья, видимые на глаз на темном фоне, тогда как контрольная капля остаётся равномерно мутной. Мы работаем с брюшнотифозными сыворотками и соответствующими культурами.

Реакция пассивной агглютинации (РПА)

Иод РПА понимают реакцию, а которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях, которые при этом склеиваются. В качестве корпускулярных носителей применяют эритроциты животных, частицы латекса (полимерные микрошарики), бентонита, сефарозы, клетки St. Aureus (штам, содержащий протеин А).

Различают 3 -гипа РПА:

1) различные варианты РПГА (реакции пассивной (емаг-. глютинации);

2) Р. коагглютинации;

3) Р латексаагглюгинации.

1. РПГА — реакция пассивной гемагглютинации. В основе лежит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов РПГА, как правило подразумевает использование эритроцитов, сенсибилизированных АТ-ми. Эритроциты используются нативные и фиксированные (формальдегидом, глутаровым альдегидом, хлоридом хрома и др).

Ингредиенты реакции РПГА:

1) растворимый (высокодисперсный) АГ (белки, полисахариды и др);

2) эритроциты (носитель);

3) АТ (испытуемая сыворотка или диагностическая иммунная сыворотка; обычно разводят в соотношении от 1:10 до 1:20480);

4) изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию инкубируют сначала при 37 ‘С з течение 2 часов, затем при комнатной температуре в течение 18-24 часов.При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции скопление эритроцитов имеет вид меленького диска с ровными краями («пуговки»).

Ставят контроли специфичности реакции с иммунной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).Контролем спонтанной агглютинации эритроцитов служат реакции со взвесью сенсибилизированных и не сенсибилизированных эритроцитов в разведенной нормальной сыворотке.

Недостатки:

1) трудность стандартизации эритроцитов при изготовлении диагностикумов;

2) небольшой срок хранения диагностикумов, Достоинства: простота и дешевизна.

Эти СР широко применяются. Например, состояние иммунитета против дифтерии у детей и подростков проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эригроцитарным диагностикумом (анатоксинным). Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл (1:20).

Необходимые ингредиенты:

1. испытуемая сыворотка;

2. диагностикум дифтерийный эритроцитарный;

3. физиологический раствор;

4. противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью ЮМЕ/мл:

5. полистироловые пластины (при их отсутствии — пробирки). Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках. Реакция ставится в объеме 0,8 мл. Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.Противодифтерийную контрольную сыворотку (с активностью 10 МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.Учет реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов, которую оценивают по 4-кратной системе:

+ + + + агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол, края купола иногда заворачиваются;

+ + + в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо;

+ + в верхней части агглютината более широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;

+ — на дне лунки образуется широкое плотное кольцо из эритроцитов; но меньшее по диаметру;

- — на дне лунки имеется плотный диск или плотное широкое кольцо, но уменьшенного диаметра, по сравнению с реакцией в +.

Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию титра антитоксина испытуемой сыворотки.

Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле:

Х = (10А)/В, где:

X — активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл;

10 — титр контрольной сыворотки в МЕ/мл;

А — максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;

В — максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.

2. Реакция коагглютинации, латексагглютинации. Диагностикум содержит стафилококки для коагглютинации и частицы латекса для латексреакции, на поверхности которых находятся АТ-ла.В случае с фиксированными клетками стафилококка связывание АТ происходит за счет взаимодействия Рс-участками 1дС с молекулами протеина А. При получении латексных диаг-ностикумов используют химическое связывание АТ или АГ с полимерной основой частиц или взаимодействие, основанное на гидрофобных силах.

Достоинства: простота постановки.

Недостаток: возможность неспецифической агглютинации.

Дата добавления: 2015-05-10