Определение общего белка

Классификация белков и их значение для жизнедеятельности организма

Пептиды – вещества, молекулы которых построены из остатков a-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. По числу аминокислотных остатков различают: дипептиды, три-, тетра-... пептиды. Пептиды, содержащие до 10 остатков называются олигопептидами, более 10 – полипептидами. Природные полипептиды с молекулярной массой более 6000 называются белками.

Белки в питании человека занимают особое место. Они выполняют ряд специфических функций, свойственных только живой материи. Белковые вещества наделяют организм пластическими свойствами, заключающимися в построении структур клеточных структур (рибосом, митохондрий и т.д.), и обеспечивают обмен между организмом и окружающей внешней средой. В обмене веществ участвуют как структурные белки клеток и тканей, так и ферментные гормональные системы. Белки координируют и регулируют все то многообразие химических превращений в организме, которое обеспечивает функционирование его как единого целого.

Пептиды имеют очень большое биомедицинское значение; особенно велика их роль в эндокринологии. Пептидами являются важнейшие гормоны человека. Их часто назначают больным для коррекции соответствующей недостаточности. Самый известный пример – введение инсулина больным сахарным диабетом. Пептидами являются также различные антибиотики и некоторые противоопухолевые препараты.

На долю белков приходится не менее 50% сухой массы органических соединений животной клетки.

Функционирование белков лежит в основе важнейших процессов жизнедеятельности организма.

По функциям белки делят на:

1. Ферменты;

2. Структурные;

3. Регуляторные;

4. Рецепторные;

5. Транспортные;

6. Защитные.

Обмен веществ (пищеварение, дыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клетки неразрывно связаны с активностью ферментов – высокоспецифических катализаторов биохимических реакций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей составляют структурные белки, например, коллаген. Важнейшую группу составляют регуляторные белки, контролирующие биосинтез белков и нуклеиновых кислот. К регуляторным белкам относятся также пептидно-белковые гормоны, которые сикретируются эндокринными железами. Информация о состоянии внешней среды, различные регуляторные сигналы воспринимаются с помощью рецепторнных белков. В активном транспорте ионов, липидов, сахаров и аминокислот через биологические мембраны участвуют транспортные белки, или белки-переносчики. К последним относятся также гемоглобин и миоглобин, осуществляющие перенос кислорода. Защитные системы высших организмов формируются защитными белками, к которым относятся иммуноглобулины (ответственные за иммунитет), белки системы свертывания крови (тромбин, фибрин) и противовирусный белок интерферон.

Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой.

По составу белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеиды), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфорпротеиды), углеводы (гликопротеины).

В соответствии с формой молекул белки подразделяют на глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свернуты в компактные глобулы сферической и элипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна (фибриллы) и высокоассиметричны. Большинство глобулярных белков, в отличие от фибриллярных, растворимы в воде.

Как уже говорилось, белки являются одним из компонентов, определяющим пищевую ценность продуктов питания. Это – наиболее ценный компонент пищи. Белки участвуют в важнейших функциях организма. Основное же значение белков заключается в их незаменимости другими пищевыми веществами.

Белки пищи в организме расщепляются до аминокислот (табл. 2.1). В

Таблица 2.1. – Аминокислоты

Наименование	Молекулярная масса	Формула
Незаменимые
Валин (Вал; Val)	117,0	C5H11O2N
Лейцин (Лей; Leu)	131,0	C6H13O2N
Изолейцин (Иле; Ile)	145,0	C7H15O2N
Метионин (Мет; Met)	149,1	C5H11O2NS
Треонин (Тре; Tre)	119,0	C4H9O3N
Лизин (Лиз; Lys)	146,0	C6H14O2N2
Фенинлаланин (Фен; Phe)	165,0	C9H11O2N
Триптофан (Три; Trp)	204,0	C11H12O2N2
Заменимые
Глицин (Гли; Gly)	43,0	С2Н5N
Аланин (Ала; Ala)	89,0	C3H7O2N
Серин (Сер; Ser)	105,0	C3H7O3N
Цистеин (Цис; Cys)	121,1	C3H7O2NS
Аспарагиновая кислота (Асп; Asp)	133,0	C4H7O4N
Глутаминовая кислота (Глу; Glu)	147,0	C5H9O4N
Аргинин (Арг; Arg)	174,0	C6H14O2N4
Тирозин (Тир; Thr)	181,0	C9H11O3N
Гистидин (Гис; His)	158,0	C6H12O2N3
Пролин (Про; Pro)	115,0	C5H9O2N

природе обнаружено около 300 аминокислот, однако в белках обнаружено только 20 из них. В результате полного гидролиза белков высвобождается до 20 a-аминокислот. Одни и те же 20 аминокислот присутствуют в белковых молекулах всех форм жизни – растений, животных, микроорганизмов.

Определенная часть аминокислот, образовавшихся в процессе расщепления белка в организме, в свою очередь, расщепляется до органических кетокислот, из которых в организме вновь синтезируются новые аминокислоты, а затем белки. Это так называемые заменимые аминокислоты. Однако восемь аминокислот, а именно:изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин и валин – не могут образовываться в организме взрослого человека из других аминокислот и поступают в организм только с пищей. Эти аминокислоты называются незаменимыми. Клетки организма человека не могут синтезировать необходимые белки, если в составе пищи отсутствует хотя бы одна незаменимая аминокислота. При недостатке незаменимых кислот задерживаются рост и развитие организма. Еще две аминокислоты, цистеин и тирозин, могут образовываться из незаменимых аминоксилот, метионина и фенилаланина, соответственно. При недостатке фенилаланина и метионина в пище цистеин и тирозин становятся незаменимыми аминокислотами. Оптимальное содержание незаменимых аминокислот в пищевом белке зависит в определенной степени от возраста, пола, профессии человека.

При сравнении фактического аминокислотного состава различных пищевых белков с оптимальным выяснилось, что не все они полноценны.

Животные и растительные белки заметно отличаются по биологической ценности. Аминокислотный состав животных белков близок к аминокислотному составу человека. Животные белки наиболее близки к «идеальному», особенно те, что содержатся в продуктах, не подвергавшейся тепловой обработке. Большинство растительных белков содержат недостаточное количество одной или даже двух-трех незаменимых аминокислот (кукуруза, зерно бедны триптофаном и лизином; бобовые содержат недостаточное количество метионина). Кроме того, растительные белки усваиваются хуже, чем животные: яиц и молока - на 96%, рыбы и мяса – на 95%, картофеля, бобовых – на 70%. Плохая усвояемость растительных белков объясняется в значительной степени содержанием в растительных продуктах клетчатки, которая снижает усвояемость и других компонентов пищи (жиров, углеводов, витаминов и минеральных веществ). Высокой ценностью обладают белки яйца и молока, они эффективно используются организмом и применяются в качестве стандарта при оценке других белков.

Недостаток в питании белка весьма чувствительно сказывается на состоянии организма. У детей при белковой недостаточности замедляется рост и умственное развитие, нарушается костеобразование. У большинства людей нарушается кровотворение, обмен жиров и витаминов (возникают гиповитаминозы), снижается сопротивляемость к инфекциям, простудам, а сами заболевания протекают с осложнениями. Надо добавить, что белки обладают заметной способностью к детоксикации некоторых ядовитых веществ в результате связывания их в трудно усваиваемые комплексы.

Вместе с тем не следует забывать об отрицательном влиянии избытка белка в питании. Из-за большой реакционной способности организм переносит избыток белков гораздо хуже, чем многих других пищевых веществ, например, жиров и углеводов. В первую очередь страдают печень и почки, так как печень перегружается от чрезмерно большого количества проступающих в нее аминокислот, а почки от выделения с мочой повышенного количества продуктов обмена белков; увеличивается вероятность заболеваний суставов, ожирения (излишнее количество белка после соответствующих превращений отчасти используется для синтеза жиров).

Норма потребления белка около 85 г «среднего» белка. В пересчете на идеальный белок – 60 г в день. Эта величина носит ориентировочный характер, так как она зависит от возраста человека, пола, характера профессиональной деятельности, физиологического состояния, климата, индивидуальных и национальных особенностей и степени загрязнения окружающей среды. Потребность в белке увеличена у младенцев и детей; возрастает она также в период беременности, лактации, заживления ран, выздоровлении и в условиях повышенной физической активности. В ежедневном рационе взрослого человека белки должны составлять в среднем 12% калорийности, 55% их – животного происхождения. Основной источник животного белка – мясо, молоко и молочные продукты, а растительного – хлеб и крупы. При этом белки в определенном соотношении должны сочетаться с другими пищевыми веществами – жирами и углеводами. Энергия, извлекаемая из углеводов и жиров, влияет на потребность в белке, поскольку она способствует сбережению белка как источника энергии. Для эффективного использования пищевого белка и для сведения потребности в нем до минимума необходимо обеспечить адекватное поступление энергии из небелковых источников, в частности из углеводов, которые оберегают белок от использования его в процессе глюкогенеза.

Состав белков непостоянен. Обычно белки состоят из углерода (50–55%), кислорода (25–30%), азота (9–15%), серы (0,5–2,5%). При анализе продуктов питания часто под словом «белок» понимается количество общего азота, определенного по Кьельдалю, умноженное на соответствующий коэффициент пересчета, указанный в таблицах (в среднем – 6,25). Метод Кьельдаля – один из наиболее широко применяемых методов анализа. Он не требует специального оборудования и удобен для серийного анализа большого количества образцов. Это стандартный метод определения белкового азота в зерне, мясе и других биологических материалах.

Суть метода состоит в том, что анализируемый образец окисляют горячей концентрированной серной кислотой; в процессе окисления связанный азот превращается в ион аммония. Затем раствор обрабатывают избытком сильного основания, в результате чего выделяется аммиак, который определяют различными методами. По способу определения количества выделившегося аммиака метод Кьельдаля может иметь титриметрическое или фотометрическое окончание.

Важнейшей стадией в методе Кьельдаля является окисление серной кислотой. Углерод и водород, содержащиеся в образце, превращаются соответственно в углекислый газ и воду. Степень превращения азота, однако, зависит от его состояния в исходном соединении. Если он присутствует в виде амида или амина, как, например, в белковых веществах, превращение его в ион аммония происходит всегда почти количественно. Если же азот присутствует в высоких степенях окисления, например, в виде нитро-, азо- и азоксигрупп, на стадии окисления образца он превращается в молекулярный азот или оксиды азота и не удерживается серной кислотой. Это приводит к занижению результатов, и чтобы предотвратить потери, образец подвергают предварительной обработке восстановителем (салициловой кислотой или тиосульфатом натрия). При такой обработке азот переходит в соединения с более низкими степенями окисления, из которых он легче превращается в ион аммония при обработке серной кислотой. Стадия окисления является наиболее длительной в методе Кьельдаля – час и более. Для ускорения стараются повысить температуру кипения серной кислоты и, следовательно, температуру процесса окисления, путем добавления нейтральной соли, например, сульфата калия. Попытки ускорить стадию окисления введением таких сильных окислителей, как хлорная кислота, перманганат калия и перекись водорода, оказались неудачными, поскольку ион аммония частично окисляется до летучих оксидов азота.

Стадию окисления катализируют многие вещества: ртуть, медь и селен – как в связанном состоянии, так и в элементном. В качестве катализаторов используют также комбинацию упомянутых веществ. Главный эффект селена состоит в том, что он сокращает время разложения до образования прозрачного раствора, хотя образование совершенно прозрачного раствора не всегда равнозначно количественному разложению вещества. Следует применять незначительное количество селенового катализатора, так как при его увеличении возрастает потеря азота. Продолжительность нагревания тоже не должна быть слишком большой. Таким образом, количество катализатора и продолжительность нагрева имеют оптимум, который необходимо учитывать.

При определении общего азота в колбу Кьельдаля (длиногорлая колба, предназначенная для окисления и отгонки аммиака) помещают точно взвешенную навеску анализируемой пробы в пергаментной бумаге, приливают серную кислоту. Для удаления образующейся пены добавляют кусочек парафина. Колбу помещают на плитку и нагревают. После завершения окисления (жидкость осветлится) содержимое колбы разбавляют водой и добавляют щелочь (30% NaOH) для выделения аммиака. Аммиак отгоняют (часто с водяным паром) в колбу с раствором кислоты.

Титритримеческое определения азота по Кьельдалю. Существуют два титриметрических способа определения собранного аммиака. В одном из них в приемник помещают известное количество стандартного раствора кислоты. По окончании отгонки избыток кислоты оттитровывают стандартным раствором щелочи. Другой удобный способ, требующий применения только одного стандартного раствора, состоит в том, что в приемник вводят некоторый избыток борной кислоты.

HBO₂ + NH₃ = NH₄⁺ + BO₂^–

Образующийся борат, количество которого эквивалентно количеству аммиака, является достаточно сильным основанием и его можно титровать стандартным раствором HCl:

BO₂^– + H₃O⁺ = HBO₂ + H₂O.

Титрование проводится потенциометрически или с использованием индикаторов.

Как уже говорилось, метод Кьельдаля позволяет выделять азот в виде аммиака только из аминов и их производных. Некоторые азотсодержащие соединения (нитро-, нитрозо-, азо-соединения и др.) в этих условиях образуют на ряду с аммиаком молекулярный азот, что приводит к получению заниженных данных. Однако, несмотря на это, метод Кьельдаля нашел широкое применения в биохимии и анализе пищевых продуктов. Метод относительно прост, легко поддается автоматизации и хорошо воспроизводим. В настоящее время процедура определения белка по Кьельдалю стандартизирована в международном масштабе и выпускается оборудование, позволяющее быстро и точно определять содержание общего азота. Такое оборудование включает блок разложения и систему дистилляции. Блоки разложения проб позволяют одновременно разлагать до 12 проб различного объема. Разложение идет под действием серной кислоты с использованием ИК-лучей и максимальная температура процесса может достигать 750ºС. Система дистилляции дает возможность отгонять аммиак с паром и титриметрически (с использованием стеклянного электрода) определять его количество. Следует отметить, что существуют такие системы, в которых и дистилляция, и титрование проводятся в автоматическом режиме и работа, как системы дистилляции, так и блока разложения контролируется микропроцессором, а результаты анализа могут регистрироваться с помощью персонального компьютера.

Фотометрическое определение азота по Кьельдалю. Для ускорения определения аммиака используется его фотометрическое определение. Фотометрически аммиак может быть определен либо по реакции с реактивом Несслера, либо по реакции образования индофенола.

При определении первым способом, к раствору, содержащему ионы аммония, добавляют реактив Несслера, представляющий собой щелочной раствор K₂[HgI₄]. Продукт реакции окрашен в красно-коричневый цвет (e = 10⁶). Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 436 нм. Концентрацию аммиака находят по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам сульфата аммония.

Красно-коричневый

436 нм е = 10⁶

Определение, основанное на образовании индофенола, заключается в совместном окислении фенола и аммиака.

NH₃ + NaOCl = NH₂Cl + NaOH

C₆H₅OH + NH₂Cl + NaOH = H₂NC₆H₄OH + NaCl

H₂NC₆H₄OH + C₆H₅OH + NH₂Cl = HOC₆H₄NHC₆H₄OH + NH₄Cl

Полученный индофенол окрашивает раствор в интенсивно синий цвет (l = 620 нм, e = 4,5·10⁴) по оптической плотности которого и определяют содержание аммиака. В качестве окислителей используют NaClO, хлорную или бромную вода, перекись водорода.

Завершая рассмотрения метода Кьельдаля, следует отметить, что этим методом определяют не чистый белок, а так называемый «сырой протеин», так как вместе с азотом белка одновременно определяется азот и других соединений: аминоксилоты, амиды, алкалоиды (кофеин и др.), неорганические азотсодержащие соединения. Содержание небелковых веществ может достигать 10%.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэф­фициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффици­енты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Существует и некоторая условность в мето­де Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использо­вании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля, как уже говорилось, является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Тех­никон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органическо­го соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота. В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядер­ном реакторе с получением изотопа ^I3N. Содержание белка рассчитыва­ют по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техни­кон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеря­ется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции вза­имодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерали­зации образца, со щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все опи­санные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроско­пии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с изве­стным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способ­ности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя име­ют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протека­нием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.

Дата добавления: 2015-05-29