LOO•+ LOO•® молекулярные продукты

LOO•+ InH ® In•+ LOOH

Последняя реакция особенно интересна, поскольку она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность этой хемилюминесценции очень мала, поэтому ее иногда называют «сверхслабым свечением». Интенсивность свечения пропорциональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а скорость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале и измерение хемилюминесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах.

Повреждающее действие пероксидации липидов. На рис.12 показаны основные мишени перекисного окисления липидов в мембранных структурах клеток. Повреждаются либо белковые структуры, либо липидный бислой в целом. В последнее время ученые уделяют все большее внимание взаимодействию мембран с нуклеиновыми кислотами в ядре и митохондриях. По-видимому, одним из результатов пероксидации липидов может стать повреждение этих молекул со всеми вытекающими последствиями.

Наиболее чувствительны к перекисному окислению липидов сульфгидрильные, или тиоловые, группы (- SH) мембранных белков: ферментов, ионных каналов и насосов. В ходе окисления тиоловых групп образуются радикалы (- S •), которые затем либо взаимодействуют друг с другом с образованием дисульфидов (- SS- ), либо связываются с кислородом с образованием сульфитов и сульфатов (- SО3и - SO4). Большую роль в патологии клетки играет также повреждение ионтранспортирующих ферментов (например, Ca2+, Mg2+-АТФазы), в активный центр которых входят тиоловые группы (рис. 12-1). Инактивация Са2+-АТФазы приводит к замедлению откачивания из клетки ионов кальция и ускорению их «протечки» в клетку (где их концентрация меньше). Это вызывает рост уровня ионов кальция в цитоплазме и повреждение клеточных структур.

Окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в мембранах клеток и митохондрий. Под действием электрического поля через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембранных структур.

Еще одним интересным примером может служить окисление белков и последующее образование белковых агрегатов в хрусталике глаза, вызванное пероксидацией липидов. Процесс приводит к помутнению хрусталика и может считаться одной из причин развития старческой и других видов катаракты у человека.

Наряду с белками и нуклеиновыми кислотами мишенью повреждающего действия перекисного окисления служит сам липидный бислой. Было показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция (рис. 12-2; 12-3). Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирование разобщаются и клетка оказывается в условиях энергетического голода. Одновременно из митохондрий в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры (см. выше).

Но, быть может, самый важный результат пероксидации - это уменьшение электрической стабильности липидного слоя, которое приводит к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом (рис. 12- 4). Электрический пробой вызывает полную потерю мембраной ее барьерных функций.

Клеточные системы защиты от повреждения свободными радикалами. Свободные радикалы преследовали живую материю с первых же моментов ее появления на Земле, и неудивительно, что в ходе эволюции клетки и организм в целом выработали нечто подобное глубокоэшелонированной обороне, которая включает в себя ферменты и низкомолекулярные соединения, в совокупности называемые антиоксидантами (табл. 10).

3.1.8. Стабильность липидного слоя мембран и явление электрического пробоя

Стабильность липидного слоя и электрический пробой мембраны. В отличие от белков и нуклеиновых кислот, которые в клетке собираются каждый по своему чертежу сложнейшими молекулярными роботами, липидный слой мембраны обладает способностью собираться сам по себе из молекул фосфолипидов и холестерина, если только они содержатся в водном растворе в достаточной концентрации. Это связано с особым свойством молекул липидов, входящих в состав мембран, которое принято называть амфифильностью, т. е. сродством одновременно к воде (гидрофильность) и к неводным средам, таким как растительное масло или жидкий парафин (гидрофобность). Молекула фосфолипида (основной липид клеточной и внутриклеточных мембран) имеет форму сплющенного цилиндра (рис. 13, А), один (меньший) конец которого хорошо растворяется в воде («полярная голова»), а другой - в воде не растворяется («жирный хвост») (рис. 13, Б). В водной среде такие молекулы самособираются в липидный бислой (рис. 13, В), который сам на себя замыкается, образуя везикулы - липосомы ( рис. 13, Г).

Под влиянием тепловых движений молекул в липидном слое могут образоваться дефекты, которые приводят к образованию заполненных водой трещин и щелей (назовем их «порами»). Через такие дефекты могут проходить водорастворимые молекулы и ионы. Однако их появление крайне невыгодно с энергетической точки зрения, поскольку при этом граница раздела липид - вода сильно увеличивается, а это требует затраты работы на преодоление силы поверхностного натяжения. С ростом радиуса поры энергия системы растет пропорционально радиусу в соответствии с уравнением:

D Е = p rl s,

где r - радиус поры; l - толщина мембраны;s - энергия образования границы раздела площадью 1м2(в системе СИ).

При наличии мембранного потенциала (т. е. разности потенциалов между водными фазами по сторонам мембраны), который обозначается как jm, энергия образования поры снижается. Как показывает теория, в этом случае энергия системы изменяется с ростом поры по уравнению:

D Е = p rl s - p r 2e0j2 m (e a - e m)/ 2 l,

где e0- диэлектрическая постоянная, e a, e m - диэлектрическая проницаемость для воды и липидного слоя мембран соответственно; j m - мембранный потенциал.

Изменение энергии поры с ростом ее радиуса при трех разных мембранных потенциалах показано на рис. 14, В. Видно, что с ростом радиуса энергия системы сначала растет, а затем начинает уменьшаться. Это означает, что после преодоления некоторого энергетического барьера рост поры будет происходить самопроизвольно, пока мембрана вообще не разрушится. Величина барьера снижается при увеличении мембранного потенциала. При небольших потенциалах, существующих в живой клетке (70мВ на цитоплазматической мембране и 175 мВ на внутренней мембране митохондрий), этого не происходит, потому что барьер достаточно высок.

С ростом потенциала может наступить момент, когда в мембране начнут формироваться и расти поры и она будет разрушена. Такое явление носит название электрического пробоя мембраны. Величина потенциала, при котором начинается электрический пробой, называется потенциалом пробоя и обычно обозначается как U * или j*. Величина потенциала пробоя, несколько различающаяся для мембран с разным составом белков и липидов, может служить количественной мерой электрической стабильности мембраны. Чем стабильнее мембрана, тем выше потенциал, который ее «пробивает» (т. е. j*).

Электрическая прочность различных мембранных структур. Явление электрического пробоя мембран изучалось многими авторами на искусственных мембранах и отдельных клетках. Мембраны обладают определенным сопротивлением R электрическому току I, которое при небольшой разности потенциалов j между двумя сторонами мембраны является постоянной величиной. Иными словами, для мембраны соблюдается закон Ома:

I =j/ R.

Это означает, что зависимость между напряжением на мембране j и током через мембрану I - линейная. Однако такая зависимость сохраняется при сравнительно небольших величинахj: обычно не выше 200-300 мВ. При определенной разности потенциалов на мембране (потенциале пробоя j*) происходит резкое возрастание тока (рис. 14, Г). При постоянном мембранном потенциале, если он превышает критическое значение, ток самопроизвольно нарастает во времени до полного разрушения мембраны.

На рис. 14 представлены результаты опыта на бислойныхлипидных мембранах. Аналогичные опыты были проведены на везикулярных мембранных структурах: фосфолипидных везикулах - липосомах, изолированных митохондриях и эритроцитах. В случае липосом и эритроцитов потенциал на мембране создавался за счет разности концентраций проникающих ионов по сторонам мембраны, в случае митохондрий - за счет энергии окисления субстратов. Измерение мембранного потенциала осуществлялось различными cпоcoбaми, например в случае митохондрий, - с помощью потенциалчувствительного флуоресцентного зонда. Явление пробоя мембран наблюдалось во всех случаях. В табл. 11 приведены величины потенциалов пробоя мембран всех этих объектов. Разумеется, потенциал пробоя во всех случаях выше потенциала, существующего на мембранах в живой клетке: иначе все мембраны пробились бы своим собственным потенциалом и клетка не могла бы существовать. Однако запас электрической прочности невелик: всего 20-30 мВ. Это означает, что при снижении прочности мембраны может произойти ее «самопробой».

Электрический пробой как универсальный механизм нарушения барьерной функции мембран. Чрезвычайно важно, что электрическая прочность мембран, мерой которой служит потенциал пробоя, снижается под действием повреждающих факторов. Как уже говорилось, основными причинами нарушения барьерных свойств мембран при патологии являются: перекисное окисление липидов, действие мембранных фосфолипаз, механическое растяжение мембран или адсорбция на них некоторых белков. Изучение влияния этих действующих факторов на электрическую прочность мембран показало, что все они снижают потенциал пробоя мембран (рис. 15).

При повреждении мембранных структур происходит снижение потенциала пробоя j* и может сложиться ситуация j* £ j, когда мембрана будет «пробиваться» собственным мембранным потенциалом. К чему это приводит в условиях живой клетки? Предположим, клетку облучают ультрафиолетовыми лучами, под влиянием которых в липидных мембранах активируется перекисное окисление. В неповрежденных митохондриях потенциал на мембране равен 175 мВ, а потенциал пробоя составляет около 200 мВ (см. табл. 11). В процессе активации перекисного окисления липидов потенциал пробоя начинает постепенно снижаться, и как только он достигает значения 175 мВ, мембрана митохондрий «пробивается» собственным мембранным потенциалом. То же происходит и при активации фосфолипаз: снижение потенциала пробоя до величины, равной существующему на мембране потенциалу, приводит к электрическому пробою мембраны и потере ею барьерных свойств. В условиях эксперимента на эритроцитах и митохондриях было показано, что осмотическое растяжение мембраны и добавление чужеродных белков, так же как и действие перекисного окисления и фосфолипазы, снижают потенциал пробоя мембран настолько, что они начинают «пробиваться» собственным мембранным потенциалом.

Естествен вопрос, почему такие, казалось бы, разные воздействия, как перекисное окисление липидов, ферментативный гидролиз фосфолипидных молекул, механическое растяжение мембраны или адсорбция полиэлектролитов, приводят к одному и тому же результату - снижению электрической прочности (т.е. уменьшению величины потенциала пробоя) мембраны? Теория электрического пробоя дает четкий ответ на этот вопрос. Самопроизвольному росту пор, случайно зародившихся в липидном бислое, препятствуют силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз: липидный слой мембраны - окружающий водный раствор. Нужно приложить довольно большую разность потенциалов к мембране, чтобы преодолеть эти силы и вызвать рост поры. Все вещества, снижающие поверхностное натяжение (детергенты), облегчают самопроизвольный рост пор и снижают величину потенциала пробоя. И продукты перекисного окисления липидов, и продукты гидролиза фосфолипидов фосфолипазами (лизолецитины), и многие белки снижают поверхностное натяжение на границе раздела фаз и таким образом уменьшают электрическую прочность мембраны. Механическое растяжение мембраны действует сходно, так как противодействует силам поверхностного натяжения. Таким образом, электрический пробой мембран оказывается универсальным механизмом нарушения барьерной функции мембран при патологии.

Мембранные системы защиты от электрического пробоя. Известны два фактора, с помощью которых живые клетки повышают электрическую стабильность своих мембранных структур: асимметричный поверхностный потенциал и холестерин.

Поверхностный потенциал возникает на мембране в случае появления на поверхности липидного слоя заряженных химических группировок, например таких, как карбоксил или фосфат. Непосредственно на липидный бислой действует потенциал, равный разности величины мембранного потенциала (т.е. потенциала между водными средами, омывающими мембрану) и поверхностного потенциала (рис. 16). За счет неодинаковой плотности зарядов на поверхностях мембраны реальная разность потенциалов, приложенная к липидному бислою, может бытьбольше или меньше трансмембранной разности потенциалов. В большинстве биологических мембран заряды распределены между поверхностями таким oбразом, что paзность потенциалов на липидном бислое меньше разности потенциалов между водными растворами, омывающими мембрану. Это снижает вероятность пробоя мембраны разностью потенциалов, которая существует между водными фазами по сторонам мембран в живых клетках.

Второй фактор, повышающий электрическую прочность мембран, - это холестерин. Было показано, что включение молекул холестерина в фосфолипидный бислой весьма заметно увеличивает электрическую прочность мембран, т. е. повышает потенциал пробоя (см. рис. 14, Г). Особенно заметно действие холестерина на поврежденные мембраны. Защитные свойства холестерина против электрического пробоя мембраны можно объяснить влиянием холестерина на вязкость липидного бислоя. Известно, что введение холестерина в фосфолипидный бислой может повысить вязкость последнего в 2-3 раза. Это приводит к замедлению об­разования и роста дефектов (пор) в липидном бислое мембран. Как уже говорилось, именно образование и увеличение дефектов в липидном бислое под действием приложенного электрического поля лежит в основе явления электрического пробоя.

Нарушение структурных (матричных) свойств липидного бислоя. Наиболее изучены три характеристики липидного слоя мембран, от которых зависят его свойства как жидкой фазы (матрицы), обеспечивающей функционирование мембранных белков и рецепторов: поверхностный заряд, вязкость и площадь липидного слоя. Все эти характеристики исследуются с помощью флуоресцентных и спиновых зондов.

Перекисное окисление липидов и действие мембранных фосфолипаз приводят к накоплению в липидной фазе мембран полиненасыщенных жирных кислот, которые придают мембране при нейтральных рH отрицательный заряд. Увеличение отрицательных зарядов на поверхности мембраны облегчает связывание с мембраной ионов и белковых молекул, несущих положительные заряды, и, наоборот, уменьшает взаимодействие мембран с отрицательно заряженными молекулами или другими мембранами. Связывая больше ионов Ca2+, мембраны с большим числом отрицательных зарядов на поверхности становятся более доступными для действия фосфолипаз, но зато хуже связывают ионы Fe2+, которые ускоряют пероксидацию липидов.

С другой стороны, при перекисном окислении липидов происходит увеличение вязкости липидного слоя мембран. Значительное увеличение вязкости имеет место также при увеличении содержания в мембранах холестерина. Возрастание вязкости приводит к торможению работы мембранных рецепторов, а также встроенных в мембраны ферментов, таких как Nа+-К+ - АТФаза и Ca2+- Mg2+-АТФаза. В свою очередь, это изменяет ионный баланс клетки и может привести к нарушениям метаболизма.

С помощью флуоресцентных зондов было показано, что при перекисном окислении происходит уменьшение площади поверхности липидного слоя мембран, а также площади, занимаемой фосфолипидами на поверхности липопротеинов плазмы крови. Это связано с окислением части жирно-кислотных цепей фосфолипидов и выходом их в водную фазу. Одним из результатов такого явления оказывается увеличение относительной концентрации холестерина в липидном монослое на поверхности липопротеинов, подвергнутых перекисному окислению.

Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в результате этого переносят еще больше холестерина в клеточные мембраны сосудистой стенки, чем неокисленные ЛПНП, и их атерогенность возрастает. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП), в норме акцептирующие холестерин с мембран клеток и обладающие антиатерогенным действием, в результате перекисного окисления полностью теряют способность акцептировать холестерин. Возрастание атерогенных (холестерин-донорных) свойств ЛПНП и утрата антиатерогенных (холестерин-акцепторных) свойств ЛПВП, несомненно, относятся к числу причин того, почему перекисное окисление липидов в районе сосудистой стенки способствует развитию атеросклероза.

3.2. ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

Повреждение, вызываемое различными болезнетворными факторами, кроме местных изменений одновременно приводит к разви­тию общих реакций организма. Степень вы­раженности общих реакций неодинакова и имеет разное проявление. К этим реакциям от­носятся стресс, реакции «острой фазы», ли­хорадка, шок, кома и др.

3.2.1. Общий адаптационный синдром (стресс)

При действии на организм различных повреждающих факторов в нем возникают двоякого рода изменения. С одной стороны, выявляется полом, повреждение, а с дру­гой - как реакция на повреждение - включаются защитно-компенсаторные ме­ханизмы. Последняя группа механизмов всегда привлекала внимание исследователей. И.П. Павлов обозначил ее как «физио­логическую меру» организма. В 1932 г. аме­риканский физиолог У. Кеннон сформули­ровал принцип гомеостазиса, суть которого заключается в том, что организм непре­рывно поддерживает постоянство внутрен­ней среды и при действии повреждающих факторов, нарушающих это постоянство, включается сложная цепь различных компенсаторно-приспособительных механизмов, направленных на его восстановление. Эти механизмы обычно стереотипны и включа­ются при действии различных повреждаю­щих факторов. Следовательно, они по своему характеру неспецифичны. У. Кеннон под­черкнул значение симпатического отдела нервной системы в этих реакциях, а Л. А. Орбели в 1935 г. сформулировал по­ложение об адаптационно-трофической ро­ли симпатической нервной системы. Было показано, что при повреждающих воздей­ствиях именно через симпатическую нерв­ную систему активируются высшие отделы центральной нервной системы, идет моби­лизация энергетических ресурсов, стимули­руется деятельность сердечно-сосудистой сис­темы, усиливается работоспособность мышц, активируются иммунологические механиз­мы и другие процессы.

Дальнейшим этапом в изучении компенсаторно-приспособительных механизмов ор­ганизма являются работы канадского пато­лога Ганса Селье. Он назвал повреждающие воздействия (например, болевое раздраже­ние, холод, возбудители инфекционных забо­леваний, яды, психические травмы и др.) термином «стрессоры» (от англ. stress - напряжение). При действии на организм они вызывают два вида реакций: специфи­ческие, связанные с качеством действую­щего фактора, и неспецифические, общие при действии различных стрессоров. Эту совокупность характерных, стереотипных об­щих ответных реакций организма на дей­ствие раздражителей самой различной приро­ды Селье обозначил как «стресс», или «об­щий адаптационный синдром». Такие ре­акции имеют прежде всего защитный ха­рактер и направлены на приспособление организма к новым условиям, на выравни­вание тех изменений, которые вызваны действующим фактором.

Заслуга Селье состоит в том, что он под­робно изучил и показал важнейшую роль в развитии общего адаптационного синдрома гипофизарно-надпочечниковой системы. Общий адаптационный синдром, по Селье, в своем развитии проходит три стадии.

Дата добавления: 2015-06-04