Гель-электрофорез

Как правило, для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5-3 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Также можно использовать полиакриламидные и более концентрированные агарозные гели. Камера для электрофореза заполняется трис-боратным буфером (рН от 8,1 до 8,2). Для исследования используют от 10 мкл до 20 мкл амплифицированиой ДНК. Электрофорез проводят при высоком напряжении (» от 10 В/см до 15 В/см). По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты. ПЦР – исследование можно интерпретировать как отрицательное или положительное в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая последовательность или нет (имеет вид компактной светящейся полоски – «бэнда»).

При проведении ПЦР необходимо учитывать возможность контаминации исследуемых проб продуктами амплификации предыдущих опытов. Это может стать причиной появления ложноположительных результатов. Поэтому оборудование, предназначенное для подготовки проб к ПЦР (микропипетки, центрифуги, пробирки и т.д.) и анализа амплифицированной ДНК должно быть отдельным, а помещения для выполнения этих этапов исследования не должны сообщаться. В идеале основные этапы проведения ПЦР рекомендуется проводить в разных зданиях.

Описанный метод «классической» направленной полимеразной цепной реакции, который используется в тест-системах первого поколения, претерпевает значительные изменения, связанные с разработкой и внедрением различных тест-систем (в том числе и отечественных), для ПЦР-диагностики второго (применяемых для количественного анализа ДНК (РНК), и третьего («сухих» тест-систем, находящихся в стадии разработки) поколений, а также различных модификаций ПЦР(лонг-ПЦР, гнездная ПЦР, РТ-ПЦР, LIPA-ПЦР-технологии, ПЦР in situ, мультиплексная ПЦР) и альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот.

Основное отличие тест-систем ПЦР второго поколения (Ген-гем-тест НС) от первого – наличие внутреннего стандарта, который представляет собой ДНК или РНК выявляемого возбудителя в концентрации от 10 до 100 молекул, которая амплифицируется одновременно с фрагментом гена инфекционного агента, но детектируется при этом в виде отдельных сигналов. Так при использовании тест-систем для ПЦР-диагностики ДНК вируса гепатита В в 3 % агарозном геле искомая последовательность выявляется в виде 350 нуклеотидных последовательностей, то есть продукты, определяемые на электрофореграмме, размещены в разных местах вследствие их различной молекулярной массы. При этом гарантируется достоверность «отрицательного» результата ПЦР-определения инфекционного агента и своевременного выявления ложноположительных результатов. Наличие внутреннего стандарта при использовании системы видеокомпьютерной детекции позволяет рассчитать концентрацию возбудителя в пробе, т.е. оценить нагрузку (вирусную, бактериальную или иной природы) – количество возбудителя в единице биологического материала. Повысить чувствительность и специфичность тест-систем второго поколения можно при использовании модификации ПЦР, такой как nested-PCR («гнездная» ПЦР) с использованием внутреннего стандарта, что нашло применение в тест-системах второго поколения, рекомендованных для диагностики ВИЧ-инфекции.

Для удобства транспортировки и хранения систем генотестирования, а также для обеспечения стандартности проведения анализов произведена разработка «сухих» тест-систем третьего поколения. Их несомненным преимуществом по сравнению с аналогичными «жидкими» тест-системами является возможность хранения и транспортировки при любой температуре (от минус 40 °С до 30 °С), ускорение и упрощение работы исполнителя. При этом тест-системы третьего поколения позволяют использовать все преимущества тест-систем первого и второго поколений в различных модификациях.

В настоящее время метод ПЦР адаптирован для выявления большинства бактерий, простейших и вирусов, имеющих медицинское значение. Особенное место данный метод приобрел в вирусологии. Благодаря своим высоким диагностическим качествам ПЦР является общепризнанным дополнением к традиционным методам, использующимся в вирусологии: размножению вируса в культуре клеток, серологическому выявлению вирусных антигенов, электронной микроскопии. Существенным преимуществом данного метода является возможность выявлять вирусы при латентных инфекциях (цитомегаловирус, вирус герпеса) и вирусы, которые трудно или пока невозможно культивировать (вирус иммунодефицита человека, вирус Эпштейна-Борр, вирус папилломы человека, вирус гепатита В и др.). С методом ПЦР связываются перспективы изучения таких заболеваний, как болезнь Крейтцфельда-Якоба, Альцгеймера, рассеянный склероз.

Дата добавления: 2015-07-02