Методы изготовления постоянных препаратов

Для изготовления постоянных препаратов используют глицерин-желатину. Одну весовую часть желатины настаивают в 6 весовых частях дистиллированной воды на протяжении нескольких часов, затем добавляют 7 весовых частей чистого глицерина и кристаллик антисептика, например, тимола или карболовой кислоты. Смесь нагревают на водяной бане, помешивая стеклянной палочкой, до полного растворения желатины. Для осаждения мути прибавляют сырой яичный белок и фильтруют через бумажный фильтр, пользуясь воронкой для горячего фильтрования и часто меняя бумагу. Остывшая глицерин-желатина должна быть прозрачной. При употреблении ее расплавляют нагреванием на водяной бане. Эта среда хорошо смешивается с водой, поэтому при ее применении отпадает необходимость в продолжительной сушке материала.

Препараты готовят следующим образом: водоросли из воды переносят в каплю глицерина и на некоторое время оставляют подсохнуть; затем каплю расплавленной глицерин-желатины наносят на нагретое предметное стекло, переносят в нее водоросли и накрывают покровным стеклом; после полного застывания глицерин-желатины края покровного стекла покрывают лаком. Такие препараты можно хранить в горизонтальном положении в течение нескольких лет.

Еще дольше сохраняются препараты, заключенные в канадский бальзам или в синтетические смолы на метилметакрилатной основе. Последние быстро твердеют, прозрачны, химически нейтральны и обладают подходящим индексом светопреломления. Перед заключением в канадский бальзам или синтетические смолы материал должен быть полностью обезвожен проводкой через спирты возрастающей крепости до абсолютного и гвоздичное масло или ксилол, которые способствуют его просветлению. Материал, окрашенный методом Гимза, помещают в кедровое масло, со временем застывающее, в котором краски сохраняются неограниченно долго.

Особые методы изготовления препаратов применяют при изучении Bacillariophyta, Dinophyta и Desmidiales, систематика которых базируется на структуре клеточных покровов. Подготовка диатомовых к микроскопированию заключается в уничтожении всех органических веществ, затемняющих структуру панциря. Это достигается либо прокаливанием материала, либо обработкой его концентрированными минеральными кислотами, в частности серной кислотой. При использовании первого метода каплю суспензии, освобожденную от примесей и содержащую клетки диатомовых, наносят на чистое обезжиренное покровное стекло, подсушивают и, поместив на слюдяную пластинку, прокаливают над пламенем горелки или на электрической плитке до полного сгорания всех органических веществ (в течение получаса и более). При изучении бентоспых диатомей, обладающих мощными панцирями, прокаливание проводят в электропечи при температуре 450°С. Если покровные стекла при продолжительном нагревании плавятся, материал прокаливают на слюдяных пластинках, а затем переносят на покровные стекла. Метод прокаливания позволяет сохранить наиболее мелкие и нежные панцири планктонных видов, не нарушает естественное расположение клеток в колонии, требует небольшого количества исследуемого материала. Однако образцы, загрязненные большим количеством органических веществ, лучше обрабатывать химическим способом (Диатомовые водоросли, 1974).

При холодной обработке кислотами пробы предварительно очищают от грубых органических и минеральных примесей на часовых стеклах, отмывают от формалина и солей дистиллированной водой путем отстаивания или центрифугирования. Полученный осадок на несколько суток заливают концентрированной серной кислотой, затем добавляют несколько кристаллов дихромата или нитрата калия и несколько раз промывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием до полного отмывания от кислоты.

Наряду с холодным методом применяют горячую обработку кислотами. При этом водоросли предварительно кипятят в течение 10-15 с в разбавленной соляной кислоте, а затем отмывают от нее. Полученный осадок с минимальным количеством воды переносят в колбу, добавляют четырех-пятикратное по объему количество концентрированной серной или азотной кислоты, заполняя колбу не более чем наполовину, и кипятят на водяной или песчаной бане под вытяжкой в течение 15 мин - 1 ч. Побуревшую массу осветляют добавлением кристаллов КNОз. После ее охлаждения оса-док пипеткой переносят в пробирку с водой, осторожно добавляя кислоту с диатомовыми в воду, чтобы избежать вскипания и разбрызгивания кислоты, и отмывают осадок до нейтральной реакции.

Полученный после прокаливания или обработки кислотами материал консервируют 2-3 %-м формальдегидом для последующего хранения или непосредственно используют для изготовления постоянных препаратов. С этой целью на тонкие, чистые, обезжиренные покровные стекла наносят суспензию с клетками диатомей и высушивают. На предметное стекло помещают небольшое количество синтетической смолы (плевракс, гиракс и др.) с индексом светопреломления выше 1,6, растапливают ее над пламенем горелки и накрывают покровным стеклом с исследуемым материалом, осторожно надавливая на него и разравнивая среду тонким равномерным слоем. Излишки среды снимают с помощью ксилола (Вассер с соавт., 1989).

Диатомовые, обладающие очень тонкими и нежными панцирями, изучают на сухих препаратах с воздушной средой. Для их изготовления суспензию с клетками диатомовых наносят на покровное стекло, высушивают, кладут на предметное стекло и заклеивают по краям лаком.

При изучении Desmidiales и панцирных Dinophyta материал обрабатывают жавелевой водой, способствующей его осветлению. Для приготовления жавелевой воды в 100 частях воды растирают 20 частей хлорной извести, доливают 100 частей 15%-го раствора карбоната калия и отстаивают в течение нескольких часов, после чего смесь многократно взбалтывают. К фильтрату постепенно добавляют раствор карбоната калия до прекращения появления осадка. После повторной фильтрации жидкость сливают в плотно закрывающийся сосуд из темного стекла и хранят в темноте. Исследуемый материал осаждают центрифугированием, осадок заливают на 1-2 суток жавелевой водой, плотно закрывая сосуд пробкой. Обработанный таким образом материал 2-3 раза отмывают дистиллированной водой. Панцири динофитовых для выявления их структуры рекомендуют после просветле-ния жавелевой водой подкрашивать трипановым голубым или спиртовым раствором иода.

Для декальцинирования водорослей, инкрустированных известью (например, Charophyceae), или живущих в известковых породах (сверлящие водоросли), применяют молочную кислоту, способствующую также просветлению препарата, а при отсутствии ее используют соляную кислоту (Топачевский, Масюк, 1984).

Дата добавления: 2014-01-03