Нм фибрилла

Классическая картинка, бусинки на нити: электронный микроскоп, обработка очень низкой ионной силой (какие-то межнуклеосомные контакты разрушаются).

В ядре такой структуры, скорее всего, нет, либо она встречается крайне редко. Там встречаются либо 30нм фибриллы, либо что-то еще более компактное.

Есть соблюдать физиологические условия, то можно из ядра выделить 30нм фибриллы. Ее структура – множество моделей, аргументы за и против каждой модели.

Первая модель, предложена рентгеноструктурщиками, которые исходят всегда из принципа регулярности (который в природе, вообще говоря, редко реализуется). Они исходили из того, что если это 30нм, то это следующий уровень компактизации, а это, скорее всего, соленоид. Когда сделали кристаллы и их изучили с помощью РСА, то правда увидели соленоид: 6 нуклеосом на виток, все соответствует диаметру 30нм. С этой точки зрения проблема решена, получены кристаллы, есть модель на основании надежного метода РСА. Что дальше рассуждать. Но проблема заключается в том, что кристаллы можно сделать только из чего-то достаточно регулярного. Кристаллизуются видимо те формы, которые именно такую структуру и имеют.

В дальнейшем с помощью целого ряда экспериментов было показано, что в действительности можно получить самые разные формы 30нм фибриллы, но эта – термодинамически наиболее стабильна. В условиях in vitro именно такая структура и получается.

Другие предложенные варианты. Зигзагообразная структура (b), есть два столбика нуклеосом, лежащих друг на друге, и все они еще закручиваются в спираль. Получается спираль с двумя осями, одна из четных нуклеосом, другая из нечетных. Сначала была сделана только модель, но потом были получены убедительные доказательства, что такая структура реально существует.

Самое убедительное доказательство было получено с помощью электронной микроскопии хроматина, который (дальше не могу понять слово, но, видимо, что-то наподобие умного разваливался), а потом мгновенно замораживался. Предполагается, что в таком виде можно увидеть нативную структуру. И увидели такой зигзаг. И его здесь хорошо видно, оба столбика нуклеосом и спейсеры перпендекулярно оси фибрилл.

Это было продемонстрировано в нескольких разных работах.

Долгое время существовала неопределенность по поводу моделей: соленоид или зигзагообразная.

Потом были сделаны модельные условные кристаллы 30нм фибриллы: был взят фрагмент ДНК, содержащий только 4 нуклеосомы, но он уже был организован в некую структуру высшего порядка. Чтобы посадить такие структуры, использовали последовательности ДНК, на которые предпочтительно садились нуклеосомы. То есть искусственно собранный кусок ДНК, на котором сидят 4 нуклеоосмы, при чем позиции каждой были строго детерминированы благодаря наличию сигнала позиционирования. Еще несколько странных вещей в этой работе: расстояние между было не 200, как в природе, а 167. Хотя с учетом сигналов позиционирования можно было сделать любое расстояние. И эта фибрилла была собрана без гистона Н1, когда известно, что в природе как раз любые структуры высшего порядка собираются с помощью Н1. Тем не менее, в таких не совсем природных условиях удалось сделать 4х нуклеосомный кристалл и РСА этого кристалла.

Анализ показал, что все соответствует модели зигзагов (2 столбика и тд). Большинство ученых какое-то время считали, что так и есть.

Нашлись те, которые обратили внимание на недостатки этой работы.

В этой работе было показано, что для того, чтобы структура держалась, довольно важны взаимодействия между N-концевыми доменами гистонов одной нуклеосомы и некой отрицательно заряженной областью на поверхности другой нуклеосомы. Особенно нужно отметить взаимодействие положительно заряженной области хвостового домена гистона Н4 с поверхностью нуклеосомной глобулы (отрицательный заряд преимущественно из гистона Н2). Если эти взаимодействия каким-то образом разрушить, то 30нм фибрилла нарушается.

Дальше люди стали пытаться собрать что-то несколько более природное. Было сделано несколько работ по структурам 30нм фибриллы, и результаты оказались достаточно интересными. Оказалось, что модель зигзага получается, если расстояния между нуклеосомами короткие и для этого не нужен гистон Н1. Если же задать расстояние порядка 200 и включить Н1, то структура получается гораздо мене регулярная: есть участки похожие на зигзаг, а другие более развернуты. И вообще, если варьировать условия, то можно собрать самые разнообразные 30нм фибриллы, может быть 6 нуклеосом на 11нм, а может быть и 11 нуклеосом на 11 нм.

Модель соленоида, если сжать сверху и снизу, то нуклеосомы залезут между других и получится очень компактная закрученная фибрилла.

Сегодня думают (скорее всего, правильно), что в природе множество различных структур, которые все могут существовать в ядре при выполнении некоторых условияй. Варьируя их, можно сделать все, что угодно.

Возможны различные агрегации структур. Вариантов множество.

Если к этому добавить еще и архитектурные белки (типа поликомб), то тогда из таких нитей можно создать очень компактные структуры (это согласуется с тем, что если фиксировать ядро и сделать его срез, то видно, что хроматин компактно упакован, но единообразия вэтой упаковке нет).

Вообще в природе не существует единообразного решения проблемы. Это логично, потому что если один механизм перестает работать, то другой может его подменить. В итоге надежность функционировать

Теперь перейдем к активному хроматину.

С самого начала, было ясно, что ДНК, которая участвует в функциональных процессах, отличается от той, которая молчит, не транскрибируется. Общий уровень компактизации высокий, и на этом фоне нужно как-то обеспечить осуществление некоторых процессов. Прежде всего, для транскрипции – должна быть менее компактна, иначе полимераза не залезет. Еще для репликации (ей нуклеосомы тоже мешают). Это относится и к репарации (белки сканируют ДНК на повреждения, например, поиск тимидиновых димеров, и тд, а на нуклеосоме это никак не найдешь). Но больше всего внимания обращали на хроматин при транскрипции. И обратили внимание, что он по-разному компактизован. Это был еще метод выделения генов (активный хроматин, значит там транскрибирующие последовательности).

Активный хроматин обладает предпочтительной чувствительностью к ДНКазе1 (это показали в 70-е годы). Это позволяло дискриминировать активный и неактивный хроматин. Метод довольно тонкий, ведь разница в чувствительности к ДНКазе может быть в 2-3 раза, не всегда детектируется легко. Если вот в эритроидных клетках сравнивать глобины и кристаллины, то при сравнении можно увидеть очевидную разницу. Но так не всегда.

Одно из ключевых наблюдений было в том, что предпочтительной чувствительностью к ДНКазе обладают не собственно транскрибирующиеся гены, а достаточно протяженные области (около 100-200 и более килобаз). Здесь показан домен, включающий в себя оваальбуминовые гены, которые активно транскрибируются, и псевдогены, которые еле-еле транскрибируются. Но при этом вся область предпочтительно чувствительна к ДНКазе, разницы нет.

Эти результаты послужили основой доменной гипотезы организации эукариотического генома. Просто люди решили все упростить. Разберемся в доменах, и все. Если есть большие участки чувствительные (или наоборот) к ДНКазе, то, наверное, эти участки представляют собой некую функциональную единицу, являющуюся и структурной единицей. Внутри этой единицы, которая должна быть чем-то ограничена, можно, меняя компактизацию, можно делать домен активный (ДНКазо-чувствительный)/неактивный (ДНКазо-резистентный).

Природа, конечно, оказалась сложнее. Но в качестве упрощенной гипотезы модель сыграла свою роль. Иногда такие механизмы действительно работают. Но геном – не мозаика из двух типов доменов, все сложнее.

Рассуждая в рамках данной модели. Должны быть механизмы, обеспечивающие равновесие между компактным и некомпактным состоянием. Эти механизмы – предмет изучения. Идея о том, что все это работает на основе перехода из развернутой структуры (бусины на нити) в 30нм фибриллу (более компактная), или еще более компактные (связь нескольких фибрилл). В модельных экспериментах было показано, что целый ряд факторов влияет на этот переход. Среди этих факторов наиболее важно ацетилирование/деацетилирование гистонов. Если гистоны ацетилированы, причем имеет значение общее ацетилирование (прежде всего Н3 и Н4 по многим позициям), это приводит к менее компактному состоянию. Деацетилирование – сворачивание хроматина в более компактные структуры, но нужны еще некоторые дополнительные белки, например, Н1 и другие линкеры. И в природе все не происходит спонтанно, поэтому важны факторы ремоделирования хроматина.

Как это можно доказать? Прежде всего, если можно выделить активный хроматин, то можно просто сравнить уровень ацетилирования гистонов по сравнению с неактивным. Самый просто способ - подобрать такие условия перевара, когда активный хроматин уже достаточно хорошо разрушен до небольших фрагментов, а неактивный имеет гораздо большие размеры. Если после такой мягкой нуклеазной обработки фракционировать по размеру, например, в сахарозной градиенте, то можно отобрать более/менее легкую фракцию. Более легкая фракция – активный хроматин. Проверяется, насколько эта фракция обогащена активными генами.

Да, все получилось, активный хроматин – высокий уровень ацетилирования гистонов. Но, все-таки, это не доказательство, что ацетилирование нужно для обеспечения свойств активного хроматина. Тут неясно, что является причиной, а что следствием. Можно предположить, что из-за транскрипции повышается уровень ацетилирования, но это не тот механизм, который регулирует уровень компактизации.

Ключевой эксперимент – in vitro собрали длинные нуклеосомные фрагменты, используя чистую ДНК и гистоны (либо ацетилированные, либо нет). Обычно гистоны можно выделить, а ферменты, которые делают ацетилирование по разным позициям, только недавно были нормально изучены, а тогда это было проблемой. Ее решили так: есть много веществ, которые являются ингибиторами гистондеацетилаз – тогда уровень ацетилирования всех гистонов резко повышается. Из таких клеток выделили суммарные гистоны, которые в среднем были существенно выше ацетилированы по всем природным позициям. И вот, собрали хроматиновые фибриллы (ксенопусные экстракты, факторы ремоделирования). Хроматин, собранный на одном и том же фрагменте ДНК, но с разными гистонами существенно отличается по уровню чувствительности к ДНКазе – обрабатывали возрастающим количеством конкретный участок (характерные две полосы). Можно увидеть такую дорожку (7), когда в хроматине, собранном из неацетилированных гистонов разрушение еще маленькое, а в другом случае больше.

То есть ацетилирование гистонов является тем механизмом, с помощью которого обеспечивается декомпактизация. То есть ацетилирования уже достаточно, чтобы 30нм фибрилла перешла в структуру бусины на нити.

А почему это происходит? Стали смотреть на больших геномных доменах, нашли хорошую корреляцию между чувствительностью к ДНКазе и ацетилированием гистонов. На рисунке бэта-глобиновый домен, активная его часть: все гистоны так или иначе ацетилированы, а где гетерохроматин – ацетилирования почти нет.

Так почему это происходит? Одно из объяснения – та самая модель (тетрануклеосомы, см.ранее) – для стабилизации чрезвычайно важны взаимодействия положительно заряженных гистонов Н4 и некой отрицательно-заряженной области (включает преимущественно Н2А, но Н2B тоже). Если с помощью ацетилирования резко снизить электростатический заряд (на лизинах), то взаимодействия не будет. И два отрицательно заряженных тогда уже могут только отталкиваться. То есть этот положительный заряд чрезвычайно важен для поддержания компактной структуры.

Если уничтожить отрицательный заряд, даже сама природа так сделала: гистон H2A Bbd – очень много представлен в активном хроматине, его негативный заряд резко снижается. И тоже эффект декомпактизации. 30нм фибриллы не могут собраться.

Активный хроматин отличается не только уровнем упаковки 30нм фибриллы, но и на уровне нуклеосом. Сначала нужно было научиться выделять нуклеосомы из активного хроматина. Это нетривиально: если просто обработать ДНКазой, конечно перевар будет, но фракции будут загрязненные, там очень много всего и тяжело сказать, что к чему относится. По счастью оказалось, что есть другой способ выделения индивидуальных нуклеосом: в активном хроматине экспонированы SH-группы, которые в неактивном хроматине закрыты (в частности, цистеины Н3) – их можно модифицировать специальными агентами, и дальше есть специальные колонки, которые связывают SH-группы (в том числе ртутная), там просто фракционируют хроматин меркаптоэтанолом, при этом весь неактивный проскакивает. Переваривают до мононуклеосом и через колонку. На колонку сядут нуклеосомы с активными генами и высоким ацетилированием гистонов.

Эти нуклеосомы еще также отличаются по форме:

Каноническая нуклеосома – скорее шарик, на который намотана ДНК, SH-группы в центре симметрии (самый консервативный кусок), если они экспонированы, значит, вся частица несколько развернута. На модели было показан такой разворот, в итоге клешнеобразная структура. Сначала просто догадки и модели, но электронный микроскоп показал, что это правда:

Важно, что активный хроматин отличается не только на уровне 30нм фибриллы, но и на уровне индивидуальных нуклеосом (менее компактны, ведь она будет транскрибироваться).

Как вообще возникают домены с повышенным уровнем ацетилирования? Они возникают посредством распространяющегося ацетилирования. Если какой-то ген должен быть включен по ходу клеточной дифференцировки (многоэтапный процесс) – сначала надо активировать хроматиновой домен, а затем активировать индивидуальный промотор. Для активации домена необходимо ацетилирование гистонов (еще ремоделирование хроматина, удаление белков гетерохроматина, замещение стандартных нуклеосом нуклеосомами, включающими в себя инвариантные формы гистонов, прежде всего Н3.3, который всегда встречается в активном хроматине). Для активации хроматинового домена нужно инициирующее событие – определенные транскрипционные факторы должны связаться с некой нишей, а потом привлечь к себе ферменты, осуществляющие модификации (в том числе гистон-ацетилазы). Точка, где проходит инициация - обычно регуляторная последовательность (промотор, а чаще энхансер). Еще привлекаются комплексы ремоделирования хроматина. И начинается реорганизация хроматинового домена.

Если последовательность, которая распознается транскрипционным фактором, входит в состав нуклеосомы, то некоторые факторы не могут ее узнать. Некоторые транскрипционные факторы способны узнавать организованную в нуклеосомы ДНК. Большинство факторов связываются с межнуклеосомными спейсерами или фрагментами ДНК, свободными от нуклеосом. Либо нуклеосома должна перемещаться благодаря факторам ремоделирования, либо нужны факторы, которые могут узнать и в составе нуклеосом.

Транскрипционный фактор привлекает гистон-ацетилазы, которые переделывают нуклеосомы (белые – нуклеосомы с ацетилированными гистонами), гистон-ацетилазы содержат субъединицы, которые узнают ацетилированный гистон, после чего привлекаются следующие ацетилазы, ацетилируется все вокруг. И все едет, либо до инсулятора, либо до столкновения с другим подобным процессом.

Распределение нуклеосом на молекуле ДНК подчиняется определенным закономерностям и может быть как близким к случайному, так и абсолютно фиксированным (фазированные нуклеосомы). Закономерности довольно мягкие. Предпочтительные позиции нуклеосом на свободной ДНК можно предсказать с помощью существующих компьютерных программ, позволяющих анализировать способность изучаемых последовательностей ДНК накручиваться на октамер гистонов.

В хроматине позиции нуклеосом могут отличаться от предсказанных в силу того, что посадка на ДНК специфичных в отношении последовательностей белковых факторов, в том числе транскрипционных факторов может препятствовать посадке нуклеосом.

Различные факторы ремоделирования хроматина перемещают нуклеосомы. Помимо всего прочего это перемещение осуществляется с тем, чтобы обеспечить регулярное расположение нуклеосом (спейсинг) вне зависимости от последовательности ДНК. Равновесная (наиболее выгодная с энергетической точки зрения) ситуация соответсвует максимальной занятости удобных мест посадки нуклеосом при сохранении правильного спейсинга Обеспечение правильного спейсинга – особая задача, для этого есть даже специальные факторы ремоделирования (чтобы такие регулярные структуры можно было упаковать далее).

После репликации исходные нуклеосомы переносятся на новую цепь и достраиваются новые (если есть вилка, то спейсинг должен быть вдвое больше, но факторы ремоделирования не позволяют этому произойти и оставляют дырки для новых нуклеосом, при этом у старых спейсинг сохраняется).

Факторы ремоделирования нужны и для освобождения сайтов связывания транскрипционных факторов.

CCAAT – участок для связывания транскрипционного фактора. Если он в нуклеосоме, то его не увидеть. То есть нуклеосому нужно двигать. И даже если она двигается в энергетически более выгодную позицию, все равно спонтанно это не происходит, потому что есть барьер, и нужен АТФ (определенный ферментная структура). Если перемещение в менее энергетически выгодную позицию, то нужно затратить еще больше энергии. Это работу выполняют комплексы ремоделирования хроматина.

Факторов ремоделирования очень много в клетке. Каждый год открывают все новые. Здесь немного устаревшая систематика. Сейчас уже 6 групп. Важно запомнить, что большинство факторов являются большими комплексами, в которых есть основная субъединица с АТФазной активностью (она – сердце), все остальное, чтобы просто привлечь этот комплекс к определенному участку – может быть привлечение к ацетилированным и метилированным гистонам, транскрипционным факторам с определенным доменом.

Основные 3 группы, которые различаются по типу АТФаз (все так классифицируют). Наиболее известная называется SWI/SNF у дрожжей. Название ничего не означает (по каким-то мутантам и фенотипам). ISWI - у дрозофиллы. CHD-родственники у дрожжей. И так далее.

Наиболее универсальная - SWI/SNF: 1) может двигать нуклеосомы налево/направо – периодическая доступность всех последовательностей, 2) может дестабилизировать нуклеосомы (менее компактна) – возможно, некоторые транскрипционные факторы теперь уже могут узнавать определенные последовательности ДНК, еще можно заменять основные гистоны на вариантные, 3) может перемещать нуклеосому на свободную ДНК, пока показано только in vitro.

NURF может двигать налево/направо – слайдинг. Нуклеосомы могут оказаться на любой последовательности.

NURD – кроме ремоделирующей активности еще активность гистон-дезацетилаз, из активно домена получается неактивный.

Схема нескольких факторов: 1 АТФазная субъединица и много вспомогательных факторов. И еще видно, что одна и та же субъединица может быть в различных комплексах.

Как осуществляется перемещение нуклеосомы? До конца неизвестно. Классическая модель – модель выпетливания: сначала образуется маленькая петелька, которая перемещается вдоль нуклеосомы с разрывом контактов, в итоге нуклеосома оказывается немного смещенной. Сейчас считается, что петелька возникает в середине (где нужно затратить больше всего энергии), а потом смещается, а раньше думали, что сбоку. Существенно, что этот механизм предполагает пошаговое перемещение нуклеосом (не скользяще): петелька связывается с разрывом 1 контакта (в нуклеосоме обычно их 14), на этот кусочек, то есть на 1/14 длины происходит смещение кора относительно ДНК, для этого тратится 1 АТФ. Чтобы переместить всю нуклеосому (разорвать все контакты) нужно 14 АТФ. Процесс энергозатратный. Ее же нужно все время туда сюда.

Есть и другая модель, но она несильно отличается. Для некоторых факторов ремоделинга первоначально показано, что перемещение на нуклеосому затаскивается дополнительная ДНК (ну 145 п.н., а 180 п.н.)

Под действием комплекса ремоделирования хроматина RSC I возникают нестабильные нуклеосомы, связывающие 180 п.н. ДНК. В составе этих, содержащих избыточные 33 п.н. ДНК, нуклеосом многие контакты ДНК с гистонами нарушены (болтающаяся нуклеосома, нестабильное состояние – может сместиться в любую сторону), в силу чего ДНК становится доступной для действия многих ферментов и снимаются накладываемые обычными нуклеосомами ограничения конформационной подвижности ДНК. По сути, эти 33 п.н. это тоже петля, так что это просто модификация старой модели.

Суммирование значения факторов ремоделирования хроматина: 1) перемещение нуклеосомы с промотора, 2) создание регулярного спейсинга (чтобы была дырка, так в природе не бывает), 3) включения гистона Н1, 4) замена основных гистонов на вариантный. 3) и 4) тоже не могут спонтанно, тоже нужна затрата энергии, этим тоже занимаются факторы ремоделирования. 5) упаковка в более компактные структуры (через изменение размера спейсера –> изменение структуры высшего порядка).

Для активно транскрибирующихся генов характерны менее регулярная нуклеосомная организация и высокий уровень мобилизации нуклеосом в 5’ концевой области. Помимо прочего, это препятствует образованию компактных хроматиновых структур, для которого необходимо регулярное расположение нуклеосом.

Если создать трасген, организованный в нуклеосомы, интегрировать в разные места, а потом сделать пробы к транскрибирующемуся и нет участку, то та проба, которая к транскрибирующемуся участку – очень смазанная картина, все существенно менее регулярно.

Последние 2-3 года мышление об организации ДНК в хроматин и роли модификаций гистонов - громадный массив данных с использованием полногеномного секвенирования. С помощью антител выделяют нуклеосомы с конкретными модификациями гистонов, а потом секвенируют на параллельном секвенаторе (Илюмина и тд). Все полученные последовательности обрабатываются биоинформатичеки, и можно смотреть распределение по всему геному. Есть дырка – анализ распределения с учетом всех клеток, для клеточной популяции (средняя температура по больнице), ведь все клетки в разных фазах (в G0 – нет необходимости компактизировать весь хроматин, S – хроматин для репликации). То есть все клетки неодинаковые. Но в первом приближении все закрывают на это глаза. И если говорить про распределение нуклеосом, то есть некие закономерности: на промоторах нет особо нуклеосом, видно дырку – нуклеосомы несколько раздвинуты. Но дырка есть и в участке терминации. Ген ведь кольцо.

В экзонах в среднем плотность нуклеосом выше (довольно существенно). Возможно это связывание с механизмами узнавания экзонов для правильного сплайсинга (было в курсе молекулярной биологии).

Факторы ремоделирования могут и закрывать промоторы нуклеосомами, если он должен быть выключен. Такие данные были получены у дрожжей (легче работать с ними, есть стимулируемые гены).

Дальше он просто перечитал слайд:

RPL17B – ген домашнего хозяйства.

Многие людей при просмотре этих картинок говорят, что здесь работает регуляторный механизм, когда посредством перемещения нуклеосом активируются/инактивируются промоторы. Но в действительности из этих данных это совсем не следует. Просто промотор закрыт или открыт, но является ли это регуляторным процессом. Может туда уже просто приехали нужные факторы (активируют хит-шоковые гены), сели, нуклеосома не может сдвинуться. То есть просто закрыты/открыты. А является ли это регуляторным событием или просто следствием других регуляторных событий, сказать сложно.

Следующая картинка. Hsf – активирует гены теплового шока. Его участок узнавания закрыт в нормальных условиях и открыт в условиях теплового шока. И все в таком роде.

Из всего этого (неважно что причина, а что следствие) следует то, что активные регуляторные элементы свободны от нуклеосом или содержат легко удаляемые нуклеосомы – участки гиперчувствительности к ДНКазе (при обработке ядер ДНКазой они атакуются в первую очередь). Эти участки не надо путать с ДНКазо-чувствительными областями (в несколько раз всего больше, очень тяжело определить их на уровне соседних последовательностей). А участки гиперчувствительности на уровне соседей видны всегда, вероятность атаки в 100 и более раз больше. Схема возникновения: рядом с промотором регуляторный участок (рядом), сначала оба закрыты. Фактор ремоделирования открывает их, они то открываются, то закрываются. Когда сели транскрипционные факторы, то все, теперь точно открыты, нуклеосомы вернуться не могут. А остальные нуклеосомы удерживают спейсинг. А потом транскрипционные факторы привлекают общие факторы транскрицпии, медиатор, полимеразу и так далее. Чтобы это все там разместилось, нуклеосоме приходиться уйти. И не одной. Все это вместе – участок гиперчувствительности. Часто регуляторные элементы на большом расстоянии – возникает несколько участков гиперчувствительности (и на них, и на промоторах). Анализ расположения участков гиперчувствительности – хороший инструмент для поиска регуляторных последовательностей. Краткая история этого всего – слайды 40-45 лекции 2.

С ними связываются транскрипционные факторы. Они все имеют модульное строение – есть ДНК-связывающий домен и активаторный. Специфичность определяется ДНК-связывающим (к нужному месту), а активаторные домены неспецифичны (объединяли с чужими ДНК-связывающими доменами, химерный белок работал с той же специфичностью, которая была у ДНК-связывающего домена). Как работает активаторный домен до конца непонятно: либо привлекает много всего, в частности факторы ремоделирования хроматина, и все по обычной схеме, либо просто необходим для стабилизации TF2D с промотором (все эти комплексы не так уж стабильны, оосбенно если плохой TATA). Обе эти схемы реализуются в равной степени.

Картирование участков гиперчувствительности к ДНКазе. Ядра обрабатываем ДНКазой, выделяем ДНК, режем рестриктазой (чтобы ограничить интересующую область). Дальше есть проба на конец фрагмента, в итоге получается полоса (полноразмерный фрагмент между рестриктными сайтами). А если есть разрыв то дополнительная полоса. Или несколько.

Участки гиперчувствительности могут быть универсальными или ткане-специфичными. Он может быть либо везде, либо только в определенном типе клеток.

Сейчас подход ушел в прошлое, все с помощью полногеномного секвенирования. Если у вас есть препарат ДНК с разрывами можно на концы разрывов повесить какой-нибудь tag (например, короткий фрагментик ДНК, содержащий биотин). Потом всю совокупность фланкирующих последовательностей выделить, и их на полногеномное секвенирование. Для большинства клеток человека это уже сделано.

Вот в альфа-глобиновом домене есть и универсальные участки гиперчувствительности, и ткане-специфичные.

Дата добавления: 2014-01-03