Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Мультигенна родина супероксиддисмутаз




В процесі еволюції з метою захисту від АФК в клітинах виробились спеціальні системи ферментативних антиоксидантів, до яких належать:

‒ СОД, яка каталізує реакцію дисмутації О₂⁻ в перекис водню;

‒ каталаза, яка розкладає Н₂О₂;

‒ глутатіон-залежні пероксидази і трансферази, котрі видаляють органічні перекиси.

Ферментативні антиоксиданти характеризуються високою специфічністю дії, яка направлена проти певних форм АФК; специфічністю клітиної і тканинної локалізації, які часто комплементарно перекриваються; специфічністю використання металів в якості каталізаторів, до яких відносяться купрум, цинк, манган, ферум і селен. Особливу роль в захисті клітин ссавців від ОС відводять пероксисомам, так як в даних клітинних компонентах в досить великих кількостях локалізовані чотири ферментативних антиоксиданти: каталаза, Cu/ZnСОД, MnСОД і глутатіонпероксидаза. Так як реакція дисмутації О₂⁻: О₂⁻ + 2Н⁺= Н₂О₂ + О₂ і розкладу Н₂О₂: Н₂О₂ =2 Н₂О + О₂, екзотермічні, то ферменти, які каталізують дані реакції, не потребують кофакторів, що робить їх роботу автономною і незалежною від функціонування інших клітиних структур [10]. Для роботи глутатіон-залежних ферментів необхідною є наявність відновленого глутатіону, який синтезується, переважно в печінці, глутатіонсинтазою чи відновлюється в реакції яку здійснює глутатіон редуктаза. Рівень внутрішньоклітинизх ферментативних антиоксидантів знаходиться під генетичним контролем. Принцип даної регуляції найкраще вивчений у бактерій, для яких показано, що підвищення внутрішньоклітинної концентрації О₂⁻ чи Н₂О₂ супроводжується активацією транскрипції генів soxRS чи oxyR- районів ДНК відповідно (регулони цих генів активуються окисненням) [30].

Показано, що активація soxRS- регулону – це адаптивна відповідь на внутрішньоклітинне продукування не лише О₂⁻, а й інших оксидантів [32].

Мутантні штами бактерій, у яких був порушений генетичний контроль вмісту ферментних антиоксидантів, стають високочутливими до токсичної дії кисню, характеризуються пониженою стійкістю до високих температур і зменшеною тривалістю життя клітин. Разом з тим, вище вказані ефекти ліквідуються додаванням антиоксидантів у культуральне середовище.

Очевидно, аналогічний тип регуляції характерний і для еукаріот, однак, експресія антиоксидантних ферментів клітинами ссавців координується як частина тканинної відповіді, якою керуються цитокіни, а не прямою дією прооксидантів на окремі клітини. У тварин, в умовах перервної гіпоксії, гіпероксії чи введенні ендотоксину, підвищується утворення АФК, зростає рівень внутрішньоклітинних ферментативних антиоксидантів, що пов′язують зі стійкістю до ОС. Аналогічні результати одержані на клітинних культурах. Показане збільшення концентрації СОД при дії фактуру некрозу пухлин (TNF), який порушує перенесення електронів у мітохондрії і збільшує утворення О₂⁻. На рівні цілого організму активність ферментативних антиоксидантів змінюється в залежності від гормонального статусу: експериментальні гормональні дисфункції (видалення наднирників і щитоподібної залози, введення дексаметазону, L-трийодтирозину і L-тироксину, індукція діабету) і додавання гормонів in vitro викликало різкі коливання активності Cu/ZnСОД, MnСОД, каталази і глутатіонпероксидази, а також синтезу перекису водню [34].

Ферментативні антиоксиданти, специфічні до певних форм АФК, локалізовані в певних клітинних компартментах, тому виникає питання: які із ферментів є найважливішими для життєдіяльності клітини? Експерементальні дослідження з інактивації ферментативних антиоксидантів антитілами і хімічними інгібіторами, чи внаслідок видалення з культурального середовища необхідних для їх синтезу іонів металів, показали, що таким ферментом є глутатіонпероксидаза, яка захищає клітини як в нормальних умовах, так і при ОС. Зниження активності внутрішньоклітинної ГПО на 21% в культурі людських фібробластів викликає загибель клітин в нормальних умовах. Для отримання такогож результату необхідно інгібувати 55% каталази в той час, як повне інгібування СОД не є летальним. В умовах ОС (2 атм 95% О₂) були потрібні значно менші ін’єкції ГПО в цитоплазму клітин, ніж СОД і каталази для захисту людських фібробластів в культурі клітин. Проведений аналіз теоретичної моделі ферментативного антиоксидантного захисту клітин також показав ключову роль ГПО і низьку ефективність СОД [32].

Сумарна активність ферментативних антиоксидантів, в перерахунку на мг білка тканин у ссавців, добре корелює із середньою тривалістю життя. Були зроблені спроби пов'язати активність окремих антиоксидантних систем з тривалістю життя у різних видів тварин, проте прямої кореляції між цими показниками не знайдено, що напевно зумовлене надмірним вмістом антиоксидантів; так зменшення рівня СОД на 50% і ГПО на 80% не впливало на тривалість життя [38]. У щурів, з віком, зменшується активність каталази і підвищується активність СОД, при цьому активність ГПО не зазнає суттєвих змін з віком, хоча, в перші 60 днів після народження виявлене деяке збільшення вмісту каталази. Вважається, що виявлена у новонароджених щурят висока активність каталази робить їх надзвичайно стійкими до гіпероксії, токсичної дії адріаміцину, до ренерфузійного пошкодження міокарда та індукованих пошкоджень мозку. Тварини з дефіцитом Cu/Zn СОД і ГПО розвиваються нормально і не відрізняються за стійкістю до гіпероксії, але вони є більш чутливими до пошкоджень міокарда, викликаного ішемією [31].

У людини на відміну від тварин, в нормальних умовах вміст ферментативних антиоксидантів є постійним і не залежить від статі, віку, ваги та інших фізіологічних параметрів. Разом з цим, ряд патологічних станів супроводжується змінами концентрацій ФАО і їх активності в клітинах і тканинах. Факти значного зниження рівня ФАО в пухлинних тканинах дозволяють припустити, що порушення синтезу ФАО може лежати в основі злоякісної трансформації клітин [24]

У дрозофіли внутрішньоклітинні захисні системи містять СОД, каталазу, глутатіон-S-трансферазу, глутатіонредуктазу, але не містять ГПО [33].

Родина супероксиддисмутаз є суттєвою складовою як клітинної. так і позаклітинної антиоксидантної системи, вперше описана McCord та Fridovich [35].

Ферменти, які належать до цієї родини – металоензими, які є продуктами різних генів. У людини до цих ензимів належать: Cu/ZnСОД (Sod1), MnСОД (Sod2) та зовнішньо- клітинна супероксиддисмутаза (ЕС- СОД, Sod3). Всі відомі дисмутази – це ферменти, які каталізують реакції дисмутації супероксидного аніону до пероксиду водню і кисню в двоетапній реакції. Перший етап – це продукція іону металу з одночасним вивільненням молекули кисню. Другий етап полягає у окисненні іону металу супероксидним аніоном і воднем з одночасним утворенням пероксиду водню [30, 33].

Cu/Zn-СОД (ЕС1.15.1.1), кодується геном Sod1 – чутлива до ціаніду і міститься в ядрі, цитоплазматичному матриксі, пероксисомах і міжмембранному просторі мітохондрій клітин еукаріот. Невелика фракція Cu/ZnСОД наявна також у внутрішньомембранному просторі мітохондрій [20]. Винятком є прокаріоти Photobakterium leiognathi, симбіонти риб, та Caulobacter erescentus, що на ранніх стадіях еволюції також були симбіонтами. Дані прокаріоти мають Cu/Zn-СОД, і вони отримали цей фермент внаслідок природного горизонтального перенесення генів від господаря. Молекула Cu/Zn-СОДскладається з двох ідентичних субодиниць, зв’язаних дисульфідним містком, з молекулярною масою 31-32 кДа. Кожна субодиниця містить один атом Cu²⁺ і один атом Zn²ˉ: вважається, що атом цинку необхідний для стабілізації молекули, в той час, як купрум бере участь у дисмутації. Методом ізоелектричного фокусування було виявлено багато ізоформ Cu/ZnСОД, при цьому в людей, в залалежності від раси, може домінувати та чи інша форма [32]. Існування численних форм фермента, очевидно, є результатом пост-трансляційної модифікації, котра не зачіпає активного центру фермента.

Поверхня фермента несе негативний заряд. Однак, в структурі молекули виявлені позитивно заряджені канали, які ведуть до активних центрів і служать для захоплень негативно заряджених молекул O²ˉ. В результаті такого захоплення іонів O²ˉ значно підвищується швидкість реакції дисмутації. СОД є одним з найбільш термостабільних глобулярних білків [38].

Ген SOD1 локалізований у 21-й хромосомі (регіон 21g22) у людини (Рис. 2) [21]. У дрозофіли ген локалізований в районі 68А7 на політенній хромосомі 3L, між генами h (hairy) і gs (gespleten) (рис. 2). Дрозофільна СОД є гомодимерним поліпептидом з молекулярною масою 15-17 кДа і має в своєму складі по два атоми купруму та цинку [33].

Геномна послідовність гена Sod1, що кодує Cu/Zn-СОД, була секвенована у дріжджів, дрозофіли, щурів [18], мишей [20] та людини [23]. Геномна організація гена Sod показує подібність між видами, має п’ять екзонів і чотири нітрони (рис. 4).

ТАТА і ССААТ блоки та GC- багаті регіони були локалізовані в усіх видів у проксимальній області промотора.

Такий високий рівень гомології 5′ фланкуючої послідовності показує, що еволюційні фактори зберегли ключові регуляторні послідовності у цьому

гені. 3′кінець гена Sod1 має декілька poly A сигнальних послідовностей, які закінчуються спеціальною mRNA різної довжини у окремих видів. YGTGTTYY консенсус послідовності і G / T кластери, необхідні для ефективного формування 3′-кінця також були розташовані нижче за течією від сигналу поліаденілірованія Sod1 гена. Промоторна область людського гена SOD1 була вивчена і є кілька передбачуваних обов'язкових сайтів для NF1, Sp1, AP1, AP2, GRE, HSF і NF-B факторів транскрипції [29]. Роль Sp1 і EGR-1 транскрипційних факторів в основній і індуцібельній експресії людського SOD1 було підтверджено [23].

 

А

Б

В

Рис.2. Хромосомна локалізація генів супероксиддимутази людини [60, 61, 62]:

А) ділянка 21-ї хромосоми із локалізованим геном Sod1 (регіон q22.11);

Б) ділянка 6-ї хромосоми із локалізованим геном Sod2 (регіонq25.3);

В) ділянка 4-ї хромосоми із локалізованим геном Sod3 (регіонp15.2)

 


А

Б

В

Рис.3. Хромосомна локалізація генів супероксиддимутази Drosophila melanogaster [33, 34, 35]:

А) ділянка 3-ї хромосоми із локалізованим геном Sod1 (регіон 68A7-68A7);

Б) ділянка 2-ї хромосоми із локалізованим геном Sod2 (регіон53D8-53D8);

В) ділянка 2-ї хромосоми із локалізованим геном Sod3 (регіон47F7-47F8)

Рис.4. Структурна організація генів SOD родини у людини [32,33,34]

 

Mn-СОД, кодується геном Sod2 – ціаніт резистентна форма СОД локалізована в мітохондріях і матриксі хлоропластів еукаріот, а також виявлена у бактерій. Mn СОД має молекулярну масу 40кДа і складається з 4 або 2 (у бактерій) субодини, що містить ⅟₂ або один іон мангану в активному центрі. По активності дана форма близька до Cu/Zn–СОД. Підвищена активність Mn-СОД спостерігається внаслідок осмотичного шоку та впливу сполук, які генерують синтез вільних радикалів [23].

Амінокислотна послідовність мітохондріальної Mn-СОД близька до такої у бактерій. Характерною особливістю даного фермента є його резистентність до перекису водню. Ген складається з п’яти екзонів і 4 інтронів (рис. 4). Ген Sod2 у дрозофіли знаходиться в 523С15 районі 2R хромосоми та в 6-й хромосомі у людини (рис. 3). Геном пітримує існування одного гена SOD2 для людини [24] і миші [26], в той час як два гени на гаплоїдний геном були описані у щурів [27]. Промоторні послідовності ТАТА і СААТ блоків є консервативними для усіх видів. Тим не менш, GC-багаті райони присутні у всіх видів. Такі функції можуть бути типовими для “housekeeping” генів [30,31]. В людини і миші гени містять передбачувані NF-B транскрипційні регуляторні елементи в 3′-фланговій області гена [26]. У миші міститься два потенційних елементи в 5′-фланговій області [28]. Також присутні в промоторні області всіх видів кілька копій Sp-1 і AP-2 консенсусних послідовностей.

В структурі геному людини був виявлений ген Sod3 [32], який є найменш охарактеризованим членом сім′ї і кодує екстрацелюлярну СОД. Фермент існує як гомотетрамер з молекулярною масою 13,5 кДа та є високоспорідненим до гепарину. Він має 40-60% гомології із Sod1, але не виявляє гомології з Sod2. В промоторних регіонах не вистачає ТАТА і СААТ послідовностей. Ген локалізований на 4-й хромосомі у людини і у 2R хромосомі у дрозофіли (регіон 47F7-47F8) (рис. 2, 3).

 

 


2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Матеріалом дослідження слугували лінії D. melanogaster:

– UAS-Sod1-RNAi –експресуєdsRNAдляRNAінтерференції гена Sod1,підконтролем UAS промотора;

– Repo-Gal4 –специфічно експресуєGal4 yгліальній тканині;

Контролем були: лінія дикого типу Oregon R, вихідні трансгенні лінії у гетерозиготному стані UAS-Sod1-RNAi /Oregon R,, Repo-Gal4/Oregon R.

Тканинно-специфічну експресію генів здійснювали за допомогою бінарної UAS-Gal4 системи [25] (рис.5)

 

 

Рис. 5. Бінарна UAS-Gal4 система експресії генів




Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2015-07-13; Просмотров: 496; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.043 сек.