Хроматография и электрофорез

Использование радиоактивных изотопов.

Использование клеток.

Даже клетки представляют собой очень сложно организованные системы. В них имеется ядро, а в окружающей его цитоплазме находятся более мелкие тельца, т.н. органеллы, различных размеров и консистенции. С помощью соответствующей методики ткань можно «гомогенизировать», а затем подвергнуть дифференциальному центрифугированию (разделению) и получить препараты, содержащие только митохондрии, только микросомы или прозрачную жидкость – цитоплазму. Эти препараты можно по отдельности инкубировать с тем соединением, метаболизм которого изучается, и таким путем установить, какие именно субклеточные структуры участвуют в его последовательных превращениях. Известны случаи, когда начальная реакция протекает в цитоплазме, ее продукт подвергается превращению в микросомах, а продукт этого превращения вступает в новую реакцию уже в митохондриях. Инкубация изучаемого вещества с живыми клетками или с гомогенатом ткани обычно не выявляет отдельные этапы его метаболизма, и только последовательные эксперименты, в которых для инкубации используются те или иные субклеточные структуры, позволяют понять всю цепочку событий.

Для изучения метаболизма какого-либо вещества необходимы: 1) соответствующие аналитические методы для определения этого вещества и его метаболитов; и 2) методы, позволяющие отличать добавленное вещество от того же вещества, уже присутствующего в данном биологическом препарате. Эти требования служили главным препятствием при изучении метаболизма до тех пор, пока не были открыты радиоактивные изотопы элементов и в первую очередь радиоактивный углерод 14C. С появлением соединений, «меченных» 14C, а также приборов для измерения слабой радиоактивности эти трудности были преодолены. Если к биологическому препарату, например к суспензии митохондрий, добавляют меченную 14C жирную кислоту, то никаких специальных анализов для определения продуктов ее превращений не требуется; чтобы оценить скорость ее использования, достаточно просто измерять радиоактивность последовательно получаемых митохондриальных фракций. Эта же методика позволяет легко отличать молекулы радиоактивной жирной кислоты, введенной экспериментатором, от молекул жирной кислоты, уже присутствовавших в митохондриях к началу эксперимента.

В дополнение к вышеупомянутым требованиям необходимы и методы, позволяющие разделять смеси, состоящие из малых количеств органических веществ. Важнейший из них – хроматография, в основе которой лежит феномен адсорбции. Разделение компонентов смеси проводят при этом либо на бумаге, либо путем адсорбции на сорбенте, которым заполняют колонки (длинные стеклянные трубки), с последующей постепенной элюцией (вымыванием) каждого из компонентов.

Разделение методом электрофореза зависит от знака и числа зарядов ионизированных молекул. Электрофорез проводят на бумаге или на каком-нибудь инертном (неактивном) носителе, таком, как крахмал, целлюлоза или каучук. Высокочувствительный и эффективный метод разделения – газовая хроматография. Им пользуются в тех случаях, когда подлежащие разделению вещества находятся в газообразном состоянии или могут быть в него переведены.

Дата добавления: 2015-07-13