КАТЕГОРИИ: Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748) |
Тема 8. Клеточные методы диагностики инфекционных болезней
Постановка и учет реакций розеткообразования
Реакцию розеткообразования проводят в пробирках Флоринско-го, смешивая равные объемы, по 0,2-0,25 мл приготовленных суспензий лимфоцитов крови исследуемых животных с рабочими взвесями соответствующих для каждой реакции эритроцитарных маркеров. При этом в смеси должно содержаться 0,5-0,75 тыс. лимфоцитов, соотношение которых с эритроцитарными маркерами должно быть в пределах 1:40-1:50. Создают условия для их взаимодействия, после которого клетки и образовавшиеся между ними комплексы фиксируют и используют для изготовления постоянных препаратов, необходимых для учета результатов реакций. Спонтанное розеткообразование. 0,25 мл лимфоцитов + 0,25 мл 0,8%-ной взвеси эритроцитов барана. Центрифугируют 3 минуты при 180 g, инкубируют 30 минут при 30°С, инкубация 18 часов при 4-10°С. В дальнейшем их фиксируют 0,5%-ным раствором глутарового альдегида 0,5 мл 20 минут при комнатной температуре. Прекращают фиксацию 4-5-кратными объемами дистиллированной воды. Центрифугируют 10 минут при 180 g. Реакции комплементарного, непрямого глобулинового и туберкулинового розеткообразования. 0,25 мл лимфоцитов + 0,25 мл 1%-ной взвеси эритроцитов быка. Центрифугируют 3 минуты при 180 g, инкубируют 10 минут при 10°С. После вышеприведенной фиксации выдерживают в течение 18-20 часов фиксированные лимфоциты глутаровым альдегидом клетки или центрифугируют 10 минут при 180 g. Надосадок убирают, оставляя 0,2 мл, тщательно ресуспендируют, делают мазок типа «высушенной капли», высушивают, фиксируют в этиловом спирте 20 минут, окрашивают по Романовскому. Подсчет ведут на 200 лимфоцитов, просматривая препараты под водной иммерсией с помощью светового микроскопа. Результат дается а процентах. За розетку принимается лимфоцит, присоединивший не менее 3 эритроцитов. После соотнесения полученных данных с результатами гематологических исследований высчитывают содержание розеткообразующих клеток в крови исследуемых животных в абсолютных значениях.
Абсолютную численность клеток популяций розеткообразующих лимфоцитов крови исследуемых животных вычисляют по формуле Ч = А ВС- 10"4, где Ч - абсолютная численность клеток популяций розеткообразующих лимфоцитов в 1 мкл крови исследуемых животных; А - абсолютная численность лейкоцитов в 1 мкл крови; В - относительное количество лимфоцитов крови; С - относительное количество клеток популяций розеткообразующих лимфоцитов крови.
Клеточные методы диагностики инфекционных болезней. Тесты Т-системы лимфоцитов. При культивировании лейкоцитов in vitro при определенных условиях нормальные лимфоциты периферической крови могут превращаться в недифференцированные зародышевые клетки типа бластов. Процесс превращения лимфоцитов на искусственной питательной среде в различные промежуточные формы получил название р е а к ц и и б л а с т т р а н с ф о р м а ц и и (РБТЛ). Морфологическая трансформация лимфоцитов может быть индуцирована специфическим и неспецифическим стимуляторами. Неспецифический стимулятор представляет собой фитогемаг-глютинин (ФГА). Под его воздействием, обычно через 72 ч, наблюдается отчетливая трансформация лимфоцитов в большие морфологические примитивные клетки, часть которых находится в состоянии митоза; используются для оценки функции лимфоцитов и т.д. Оценку трансформации и пролиферации лимфоцитов под влиянием специфических антигенов применяют в основном для диагностики аллергии. П о к а з а т е л ь п о в р е ж д а е м о с т и н е й т р о ф и л о в (ППН). В сенсибилизированном организме элементы белой крови, в том числе нейтрофилы, проявляют повышенную чувствительность к аллергену. Учитываемый критерий повреждения нейтрофилов — усиление амебоидной реакции этих лейкоцитов при инкубации крови в смеси со специфическим аллергеном. Для повышения точности наблюдения за поврежденными нейтрофилами используют чисто химический метод окраски клеток на гликоген по А. Л. Шабадашу, который позволяет точнее отдифференцировать нейтрофильные лейкоциты от других форменных элементов крови (эозинофилы, лимфоциты и моноциты содержат значительно меньше гликогена, а в эритроцитах он отсутствует) и обнаружить даже минимальные повреждения нейтрофилов (в виде амебоидных реакций).
Количество обнаруживаемых поврежденных нейтрофилов, например в присутствии туберкулина у больных туберкулезом, находится в прямой зависимости от степени активности специфического процесса (процент поврежденных нейтрофилов в активной фазе туберкулеза в 1,5—3,5 раза выше, чем при затихании процесса). Сегментоядерные нейтрофилы претерпевают аллергическую перестройку значительно раньше, чем наружные кожные покровы. Р е а к ц и я с п е ц и ф и ч е с к о г о л е й к о л и з а. Основана на повреждении — разрушении лейкоцитов под влиянием аллергена; первично повреждаются лимфоциты, а остальные лейкоциты — вторично. Механизм специфического лейколиза заключается в воздействии аллергена на лимфоциты сенсибилизированного организма. Реакция служит для диагностики аллергических состояний у животных. Р е а к ц и я и н г и б и ц и и м и г р а ц и и л е й к о ц и т о в. Основана на подавлении миграции макрофагов и лейкоцитов под действием медиаторов, вырабатывающихся сенсибилизирующимися лимфоцитами в присутствии специфического антигена. С п е ц и ф и ч е с к о е р о з е т к о о б р а з о в а н и е. Основано на следующем феномене: В-лимфоциты животного, иммунизированного гетерогенными эритроцитами, способны in vitro фиксировать на своей поверхности соответствующие эритроциты, образуя «розетки». Реакция получила название «иммуноцитоприлипание». Воспроизводится in vitro, если сенсибилизированные лимфоциты смешивают со взвесью танизированных эритроцитов, на которых фиксируются соответствующие аллергены.
Ф а г о ц и т а р н а я а к т и в н о с т ь л е й к о ц и т о в. Ведущую роль в фагоцитозе играют нейтрофильные гранулоциты и макрофаги. Активность нейтрофильных гранулоцитов можно установить несколькими методами, принимая во внимание следующее: способность к адгезии — определение количества клеток, фиксирующихся на стеклянной пластинке при 37 °С; миграцию — выход нейтрофильных гранулоцитов из капилляров в окружающую ткань (метод «кожного окна»); хемотоксис — способность клеток перемещаться в направлении химического градиента; фагоцитарную активность — способность захватывать и уничтожать бактерии. Этот тест наиболее полно характеризует функциональные способности нейтрофильных гранулоцитов и широко применяется для оценки уровня клеточной неспецифической резистентности. При постановке фагоцитарной реакции учитывают три показателя: активность фагоцитоза (фагоцитарный показатель, процент фагоцитоза) — процент фагоцитарных бактерий; интенсивность фагоцитоза (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число) — среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофильным гранулоцитом; завершенность фагоцитоза (индекс переваривания) — отношение числа погибших микробных клеток к живым в мазке или снижение интенсивности роста микробов после контакта их с кровью. Р е а к ц и я б е с с у б с т р а т н о го в о с с т а н о в л е н и я н и т р о с и н е г о т е т р а з о л и я (НСТ-тест). Основана на уникальной способности фагоцитов утилизировать кислород с образованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ-тест принадлежит к чувствительным индикаторам нормы и патологии. НСТ-тест предложен для разграничения острых бактериальных и вирусных инфекций.
Контрольные вопросы. 1. Какие клетки принимают участие в развитии иммунного ответа? 2. Как осуществляется регуляция иммунного ответа? 3. Как осуществляется генетический контроль иммунного ответа? 4. Какие клетки участвуют в реакциях клеточного иммунитета? 5. Какие вы знаете медиаторы клеточного иммунитета?
Дата добавления: 2015-07-13; Просмотров: 3154; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы! Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет |