Конвенциональная ПЦР

Молекулярно-генетические методы диагностики. Амплификационные технологии: конвенциональная ПЦР, ПЦР в реальном времени. Некоторые разновидности ПЦР: ПЦР с обратной транскрипцией, мультиплексная ПЦР и др. Области применения генетических технологий.

Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии- клонирующий вектор, эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазы, клонирование ДНК. Применение генной инженерии в микробиологической биотехнологии: создание диагностических, лечебных и профилактических препаратов.

Генетические рекомбинации у бактерий. Типы рекомбинации по молекулярному механизму. Способы переноса генетического материала из клетки в клетку. Трансдукция: сущность, типы трансдукции, значение.

Генетические рекомбинации по молекулярному механизму делятся на гомологичную, сайт-специфическую и незаконную рекомбинацию.

Трансдукция- процесс переноса генетического материала от бактерии-донора к бактерии-рецепиенту с помощью бактериофага. Трансдукция осуществляется дефектными бактериофагами, которые не способны к самостоятельной репродукции в клетке и для формирования фагового потомства нуждаются в присутствии родственного фага.

Типы трансдукции: неспецифическая (общая) и специфическая (локализованная) и абортивная.

Спомощью трансдукции происходит перенос бактериальных генов, плазмид и транспозонов, что используется в генной инженерии.

Генная инженерия- раздел молекулярной генетики, представляющий собой совокупность методов и технологий для создания in vitro рекомбинантных молекул ДНК или РНК и способов их переноса. В результате клетки, получившие чужеродные гены, приобретают способность синтезировать белки, которые они ранее не синтезировали.

Рекомбинантные молекулы содержат два компонента- вектор(переносчик) и клонируемую “чужеродную” ДНК.

Векторами являются циркулярно замкнутные молекулы ДНК- плазмиды, умеренные бактериофаги или вирусы животных, иногда космиды(плазмиды с липкими концами, cos-сайтами ДНК бактериофага лямбда). Они должны обладать рядом свойств, в частности:

- самостоятельно реплицироваться

- нести в своем составе участки рестрикции

- содержать маркеры фенотипа

Клонируемые молекулы ДНК- это фрагменты ДНК, имеющие определённые гены, кодирующие синтез нужного вещества. Их получают экстракцией натриевой ДНК, с помощью фермента обратной транскриптазы на молекуле и-РНК и синтезов генов химическим способом.

Рекомбинантную молекулу ДНК можно получить с помощью фермента рестриктазы. Обрабатываются ДНК вектора и изолированные ДНК эндонуклеазой рестрикции,которая расщепляет взятые молекулы ДНК в строго определенном месте с образованием однонитчатых, комплементарных друг друг концов. Далее фермент полинуклеотидлигаза сшивает две разные линейные молекулы ДНК в одну рекомбинантную ДНК.

Генная инженерия применяется для переноса генной информации из одной клетки в другую,преодолевая даже межвидовые барьеры; для создания микроорганизмов-продуцентов ферментов, гормонов, вакцин, антигенных препаратов и т.д.

Молекулярно-генетические методы- методы, позволяющие в генетических материалах обнаруживать фрагменты геномов.

ПЦР- метод получения большого количества специфических нуклеотидных последовательностей ДНК in vitro. Амплификация-умножение определенных генов или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и индентифицирован.

Этапы:

1. Денатурация- разъединение определяемой двухцепочечной ДНК на две изолированные цепочки при нагревании до 90-95 градусов по Цельсию в течении 0.5-1 минут.

2. Отжиг- восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера при температуре 40-60 0.5 минут.

3. Удлинение (элонгация)- достройка каждой цепи определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК- полимеразы- проводится при температуре 70-75 в течение 2-5 минут.

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Дата добавления: 2015-08-31