Метод виявлення гормону кортизолу у сироватці крові

Імуноферментним аналізом називають лабораторні дослідження, що базуються на специфічності і високого ступеня вибірковості імунологічної реакції "антиген-антитіло". Прийнято розрізняти кілька десятків варіацій ІФА. Найбільшою популярністю користується гетерогенний твердофазний імунний аналіз. Основою цього методу є реакція “антиген – антитіло”, тобто специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Рис. 2.5. – Імуноферментний твердофазний аналіз

Для кількісного аналізу застосовують в основному два види виконання імуноферментного аналізу. Першим етапом їх здійснення виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Дальше стає можливим проведення реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з імобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решта суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже імобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, які містять речовину, що визначають, поміщають у лунки планшету для мікротитрування, на стінках якого сорбовані антитіла, здатні специфічно зв’язувати дану речовину, наприклад гормон. Одночасно в інкубаційну суміш вносять невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат. Кон’югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після цього як зв’язування антигенів відбулося, незв’язані молекули відмивають.

Для визначення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і забарвлені продукти ферментативної реакції визначають фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється за допомогою калібрувальної кривої, яку будують за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Для проведення аналізу використовувався набор «Стероид ИФА-кортизол» від Алкор-Біо (Росія) з використанням варіанту конкурентного твердофазного імуноферментного аналізу.

Рис.2.6. – Набор «Стероiд IФА-кортизол»

В лунках, при додаванні досліджуваного зразка та кон’юганту кортизол-перксидази, під час інкубації встановлюється рівновага між кон’югантом та ендогенним кортизолом сироватки крові в процесі зв’язування з антитілами, іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок.

Незв’язані компоненти видаляються промиванням. Кількість зв’язаного антитілами кон’юганту зворотно пропорційна кількості кортизолу в дослідженому зразку крові.

Під час інкубації з розчином ТМБ відбувається забарвлення розчину в лунках. Ступень забарвлення зворотньопропорціна концентрації кортизолу в аналізуємих пробах. Після зміни оптичної щільності розчину у лунках на основі калібрувального графіку розраховується концентрація кортизолу в досліджуванних зразках.

Стрiпи. Перед відкриттям пакету зі стрипами вони витримувалися при кімнатній температурі (+18…25°С) не менше ніж 30 хвилин. Після відкриття пакет ставиться на вільну рамку необхідна кількість стрипів.

Перед відкриттям флакони були злегка простукані для того, щоб стряхнути частинки, що поприлипали до стінок флаконів. Відкриваті флакони та кришки було перегорнуто та покладено на суху поверхню. До кожного флакону з калібрувальною пробою та контрольною сироваткою додали по 0,5 мл дистильованої води та закрили кришками. Флакони були витримані впродовж 10 хвилин при кімнатній температурі (+18…25°С) без перемішування. Потім, акуратно нахиляючи та обертаючи флакони, перемішали їх зміст до повного розчину, уникаючи піноутворення. Впродовж наступних 10 хвилин флакони були витримані при кімнатній температурі, періодично помішуючи.

Кон’югант у наборі готовий до використання. Витрати кон’юганту на один стрип склали 1,5 мл.

Промивний розчин. Необхідну кількість буферу Р було розведено дистильованою водою у 20 разів. Потім ретельно перемішішано, уникаючи піноутворення.

Розчин тетраметилбензидину (ТМБ) готовий до використання. Витрата ТМБ на один стрип складали 1,15 мл.

Стоп-реагент у наборі готовий до використання. Витрата стоп-реагенту на один стрип складали 1,15 мл.

Усі реагенти перед проведенням аналізу ретельно перемішали та довели до кімнатної температури.

Дата добавления: 2015-08-31