Влияние генетических, физических и химических факторов на рост и развитие культуры клеток и тканей, на синтез вторичных метаболитов

Примеры биотехнологического использования клеточных культур в промышленных масштабах

Биотехнологическое использование клеточных культур в качестве сырья в промышленных масштабах становится реальностью. В виде примеров можно привести производство шиконина из Lithospermum erythrorhison в Японии (фирма Toshiba) – ценного для косметики, пищевой промышленности и медицины растительного нафтохинонового пигмента. В России производство культуры ткани женьшеня («Биоженьшень») осуществляется на биохимических заводах. Экстракт, получаемый из биомассы женьшеня, используется в качестве биологически активной добавки к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности – для приготовления тонизирующих напитков. Для получения ценного противоаритмического препарата аймалина на ХПХФО «Здоровье»(Харьков, Украина) организовано опытное производство биомассы культуры тканей Rauwolfia serpentina. Таким образом, возможности, открытые методом культуры тканей, позволили в настоящее время создать биотехнологическое производство принципиально новых видов сырья для получения необходимых соединений.

На культивирование клеток оказывают влияние многие факторы, такие как:

1. генетика экспланта (выбор вида растения, выбор конкретного растения донора);

2. эпигенетика экспланта (выбор органа растения);

3. генетика популяции клеток (культивирование (селекция) культуры, получение мутантов);

4.физиология популяции клеток (оптимизация условий (химических и физических факторов) роста и синтеза вторичных соединений)

А) Химические факторы.

Углеводное питание. Как показано в многочисленных работах, культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений). Как правило, лучший рост отмечается на двух сахарах – глюкозе или сахарозе. В то же время высокий уровень синтеза свойственен культурам на сахарозе. На средах с глюкозой синтез часто сильно ослаблен. Причины этого явления не ясны.

Минеральное питание. Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений, при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ухудшению синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после исчерпания фосфора из среды. Высокие концентрации фосфора в среде снижают синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая. В то же время имеются сообщения о повышении содержания вторичных соединений при повышенных концентрациях фосфора – алкалоидов в клетках барвинка розового, антрахинонов в культуре клеток Galium.

Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. Органические формы – пептон, дрожжевой экстракт и другие – тормозят и рост, и синтез. Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию – повышение доли нитратного азота способствует увеличению синтеза вторичных веществ, в частности, диосгенина в культуре клеток диоскореи.

Фитогормоны. Эти компоненты среды привлекают наибольшее внимание исследователей. Однако влияние гормонов на синтез вторичных соединений в культуре клеток неоднозначно и может изменяться в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и др. Наиболее интенсивно изучались ауксины и цитокинины, так как они, как правило, являются необходимыми компонентами сред. Имеется большое число примеров, когда ауксины стимулировали синтез вторичных соединений, и примерно столько же, когда подавляли.

Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культурах моркови и тополя, антрахинонов в Cassia fistula, Cassia torra, сапогенинов в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахинонов и шиконина в воробейнике, скополамина – в белене, хлорогеновой кислоты – в табаке.

Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерности. Результаты по другим классам других фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.

РН среды. По влиянию рН среды на синтез вторичных соединений данных очень немного. Однако, по имеющимся сведениям, рН среды существенно влияет на этот процесс. Например, при изучении синтеза индола в культуре клеток ипомеи в условиях рН-стата оказалось, что при рН 6,3 синтез индола максимален и в два раза превышает уровень синтеза без рН-статирования. В рН-стате при уровне рН 4,8 синтез полностью прекращается.

Б) Физические факторы.

Аэрация. Очень важный фактор, но практических данных немного. Важно как значение расхода кислорода, так и соотношение СО₂/О₂. Высокое отношение О₂/СО₂ может ингибировать и рост и синтез вторичных продуктов.

Температура. Влияние температуры на синтез вторичных метаболитов изучалось лишь в нескольких работах. Показано, например, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при 27°, уклонение на 5° в любую сторону приводит к снижению синтеза более чем в 3 раза.

Свет. Этому фактору посвящено наибольшее число работ. При этом разбирается как полная индукция синтезов, так и влияние на количество соединений света разной интенсивности и качества.

Свет увеличивает содержание эпикатехинов и протоантоцианидов в культуре клеток чая, серпентина в барвинке, витамина В6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте. Красный цвет увеличивает синтез подофиллотоксина в культивируемых клетках подофилла.

Достаточно часто освещение изменяет соотношение разных классов вторичных соединений. В то же время часто свет выключает или снижает синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре клеток дурмана происходит только в темноте, освещение снижает содержание алкалоидов в клетках культуры хинного дерева, шиконина – в культуре клеток воробейника. В последнем случае показано, что свет разрушает ФМН, необходимый для синтеза шиконина.

В) Генетические факторы.

Культуры клеток растений характеризуются большой степенью генетической гетерогенности клеток в популяции. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома – на уровне точечных мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. Гетерогенность клеточной популяции позволяет с помощью клонирования отбирать линии клеток с сильно изменёнными свойствами, в частности с повышенным синтезом вторичных метаболитов. Таким образом были отобраны штаммы – продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина. Однако судьба отобранных клонов при длительном культивировании различна: в одних случаях синтез вторичных метаболитов в клонах нестабилен и возвращается на уровень исходной культуры, в других случаях клон достаточно стабилен. Причины такого различия в поведении не ясны. Наконец, максимальные изменения генома культивируемых клеток могут быть получены в результате индуцированного мутагенеза. В полученных мутантных штаммах возможны резкие качественные и количественные изменения синтезов вторичных соединений.

Дата добавления: 2015-07-13