Построение калибровочного графика

Ход работы

Исследуемый материал и реактивы

Лабораторная работа №22

Определение активности аспартатаминотрансферазы(аланинаминотрансферазы) по методу Райтмана-Френкеля(набором реагентов)

Аминотрансферазы (трансаминазы) – ферменты, осуществляющие трансаминирование аминокислот, содержащие в качестве кофермента фосфопиридоксаль. Аминотрансферазы относятся к индикаторным ферментам, так как трансаминазы обладают высокой активностью внутри клеток различных тканей и органов человека и сравнительно низкой активностью в крови (в тысячу раз ниже). Содержание этих ферментов в тканях неодинакова, так, аспартатаминотрансфераза (АсАТ) в наибольших количествах содержится в печени и сердечной мышце; содержание аланинаминотрансферазы (АлАТ) в печени во много раз выше, чем в сердце. Поэтому определение их активности широко применяется в диагностике заболеваний сердца и печени. Нормальные концентрации АсАТ (или АлАТ) – 0,14-0,68 ммоль/л*ч (0,028-0,19 ммкат/л).

В клинике трансаминазный тест используется не только для постановки диагноза заболевания, но и для прогноза и проверки эффективности методов лечения.

Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием аминотрансфераз, образуются щавелевоуксусная (ЩУК) и пировиноградная (ПВК) кислоты, которые в щелочной среде образуют с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенные гидразоны. Интенсивность окраски пропорциональна активности ферментов и измеряется фотометрически.

1. Сыворотка крови. 2. Субстратный раствор для определения АСТ – 100 мл (D.L.-аспарагиновая кислота – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Субстратный раствор для определения АЛТ – 100 мл (D.L.-аланин – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ) – 1 ммоль/л – 100 мл. 4. Стандартный раствор пирувата натрия – 2 ммоль/л – 3 мл. 5. Натрий едкий – 16г (0,4 моль). 6. Физиологический раствор.

Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-8⁰С.

Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре.

А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0,25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 37⁰С в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови, инкубируют при 37⁰С 60 минут. Затем добавляют 0,25 мл 2,4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2,5 мл 0,4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы.

Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику.

В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-25⁰С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.

№ п/п	Стандартный р-р пирувата натрия	Физиологич. раствор	Субстратный раствор АлАТ/АсАТ	Активность фермента (АсАТ, АлАТ)
мл	мл	мл	ммоль/(ч*л)	мккат/л
	0,05	0,1	0,45	1,0	0,28
	0,1	0,1	0,40	2,0	0,56
	0,15	0,1	0,35	3,0	0,83
	0,2	0,1	0,30	4,0	1,11
	0,25	0,1	0,25	5,0	1,39
контроль	–	0,1	0,50

Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»).

Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).

Дата добавления: 2017-02-01