Ферменти генної інженерії

У генетичній інженерії використовують ферменти, отримані з бактерій або клітин тварин, що культивуються invitro, і заражені вірусами. Ці ферменти дозволяють проводити різні маніпуляції з молекулами ДНК: розрізати у певних місцях, з'єднувати різні за походженням фрагменти, синтезувати нові послідовності, що не існують у природі та ін.. До основних ферментів генної інженерії належать: ДНК-полімерази; РНК-полімерази; рестриктази; лігази;зворотна транскриптаза або ревертаза і нуклеази.

ДНК-полімерази. В основі реплікації ДНК (створення копій, самоподвоєння) покладено принцип компліментарності − спарування певних нуклеотидних основ (гуанін до цитозіну, аденін до тиміну) і матричний спосіб синтезу дочірньої ДНК. Реплікація починається з певної ділянки дволанцюгової молекули ДНК (реплікаційної вилки) і здійснюється одночасно у двох ланцюгах, що поступово роз'єднуються. Дочірній ланцюг синтезується за допомогою ферментів − ДНК-полімераз (див. розділ 2.1).

У клітинах кишкової палички Е. соli знайдено три різних ДНК-полімерази, які розрізняються за швидкістю каталізу реакції синтезу нових ланцюгів ДНК, а також за нуклеазною активністю.

Швидкість реплікації в хромосомах прокаріот становить 1000 нуклеотидів за секунду, а для еукаріот − близько 100 нуклеотидів.

ДНК-полімераза І - не є основним ферментом реплікації, але вона володіє функцією корекції, оскільки вилучає нуклеотиди, що були включені у ланцюг помилково. Функції ДНК-полімерази IIще не з'ясовані. Активність цього ферменту низька і становить лише 5% активності ДНК-полімерази І.

Головним білком при синтезі і реплікації нового ланцюга ДНК хромосоми є ДНК-полімераза III, що є дійсним ферментом реплікації хромосом. Молекули цього ферменту полімеризують до 15000 нуклеотидів за хвилину за температури 37°С.

РНК-полімерази. Незважаючи на високу ферментативну активність, ДНК-полімерази не здатні ініціювати синтез дочірніх полінуклеотидних ланцюгів. Цю роль виконують РНК-полімерази. Фермент РНК-полімераза знаходить промотори, активізує матрицю ДНК і відбувається локальне розплетення подвійної спіралі ДНК. Однак, основна роль РНК-полімераз полягає у каталізі процесу транскрипції (тобто створенні РНК на підставі ланцюгу ДНК). У прокаріот процес транскрипції каталізує одна РНК-полімераза, а в еукаріот – три: РНК-полімераза І бере участь у біосинтезі високомолекулярних рибосомних РНК, РНК-полімеразаII– у процесі транскрипції генів, що кодують білки, а РНК-полімеразаIII– у синтезі низькомолекулярних РНК (див. розділ 2.3.1).

Рестриктази. Ферменти цього типу були відкриті внаслідок вивчення механізму явища, яке дістало назву «рестрикція (обмеження), що контролюється господарем» (host-controlledrestriction). У 50-х роках попереднього століття було встановлено, щоздатність бактеріального вірусу (фагу) до росту на певних бактеріальних культурах може залежати від штаму, в якому цей фаг розмножувався останнім разом.

Експериментами із радіоактивно міченим бактеріофагом виявили, що обмеження росту (рестрикція) фага пов'язане із ферментативною деградацією його ДНК у бактеріальній клітині. Клітинна ДНК захищена від деградації штамоспецифічною модифікацією, яка полягає у метиліруванні нуклеотидів. Ці результати дали можливість запропонувати гіпотезу біохімічних механізмів рестрикції і модифікації. Відкриття ферментів рестрикції-ендодезоксирибонуклеаз, або рестриктаз, − і ферментів модифікації

-ДНК-метилтрансфераз, що називають ДНК-метилазами,− повністюїї підтвердило.

Рестриктази розпізнають певні послідовності нуклеотидів (сайти рестрикції) і розрізають дволанцюгову ДНК на фрагменти. Модифікація полягає у метиліруванні певних основ у послідовності, які розпізнає сполучена рестриктаза; тим самим забезпечується захист даної ділянки ДНК від впливу рестриктази. Одночасне існування в клітині цих двох ферментативних активностей (так звана R-M-система) запобігає гідролізу власної нуклеїнової кислоти. Чужорідна ДНК, потрапляючи у бактеріальну клітину, є субстратом для обох ферментів.

Назва рестриктаз складається з початкових літер латинської назви виду бактерій, з якого був виділений фрагмент, наприклад, Есо − Е. соli. У тому разі, коли різні за специфічністю дії рестриктази присутні в клітинах різних штамів одного виду бактерій, у назву рестриктази вводять додаткову букву, наприклад, рестриктази Ніпс і Hind виділені з бактеріальних клітин Haemophilusinfluenzae, штами і d. Цифри, наступні за літерними позначеннями, відображають послідовність відкриття відповідних рестриктаз у клітинах бактерій одного виду, наприклад, Нае І, Нае II и Нае III із Н. aegipticus.

Залежно від характеру розрізання рестриктази поділяються на три групи. Рестриктази І типу розрізають молекулу ДНК у будь-якому місці й не мають певного сайту рестрикції. Ці рестриктази неможливо використовувати для вирішення завдань генної інженерії.

Рестриктази II типу мають певні сайти рестрикції, розпізнають певну послідовність нуклеотидів і гідролізують ланцюг усередині сайту. Сайти рестрикції рестриктаз IIтипу наведено симетричними за повороту на 180° послідовностями − паліндромами:

5'GAATTC3'

3' CTTAAG5' −сайт рестрикції рестриктази EcoR 1

5'TAGA3'

З' АТСТ 5' - сайт рестрикції рестриктази Taq1

Рестриктази IIтипу розрізняються залежно від розміру сайту рестрикції і довжини отриманих фрагментів:

1. − дрібно розрізані− сайт рестрикції складаються з 4 парнуклеотидів(п.н.);

2. −середньо розрізані - сайт рестрикції - 6... 8 п.н.;

3. −крупно розрізані − сайт рестрикції − 10...14 п.н.

РестриктазиII типу розщеплюють послідовність ДНК по-різному. Одні вносять розрив по осі симетрії послідовності, якурозпізнають, а інші − зі здвигом, з утворенням «сходинки».

У першому випадку створюються так звані «тупі кінці»:

5'TA GA3' 5'GTT AAC3'

3' AT СТ 5' Taq1 3' САА TTG5' Ніпс 1

Якщо точки розщеплення протилежних ланцюгів ДНК зміщеніодна відносно іншої у сайті рестрикції, то кінці ДНК, щоутворюються внаслідок рестрикції, містять виступаючіодноланцюгові ділянки. Оскільки такі ділянки комплементарні самісобі і одна одній і можуть між собою взаємодіяти, їх часто називають «липкими кінцями».

5'G ААТТСЗ' 5'C CGG3'

З' СТТАА G 5' EcoR 1 З'GGC С 5' НраII

Послідовність нуклеотидів, що створюють «липкі» кінці, є унікальними для кожного такого сайту рестрикції. Внаслідок цього рестрикційні фрагменти ДНК, що утворилися під дією даної рестриктази, в суміші з'єднуються один з одним лише в точно визначеній вихідній послідовності, яка задається унікальними послідовностями нуклеотидів у «липких» кінцях рестрикційних фрагментів ДНК.

Фрагменти з «тупими» кінцями можуть бути з'єднані незалежно від того, якою рестриктазою вони були створені. Фрагменти з «липкими» кінцями більш сприятливі для створення рекомбінантних ДНК, оскільки лігаза забезпечує з'єднання фрагментів без перешкод.

Рестриктази III певним чином подібні до рестриктаз І. Вони розпізнають несиметричні послідовності завдовжки 5...6 п.н. і розщеплюють ДНК на відстані 24...27 п.н. від сайту рестрикції, при цьому створюються одноланцюгові кінці завдовжки 2...З нуклеотиди. Дія ферментів даного класу invitro не забезпечує вичерпний гідроліз молекули ДНК.

ДНК-метилази. Більшість штамів Е. соli містить два типи ферментів, що метилірують ДНК: dam -і dcm-метилази. Перша здійснює перенесення метильних груп до N-положення аденіну в послідовності GATC. У такому разі багато рестриктаз (наприклад, Bcll, МbоІ або СІаІ), до складу сайтів рестрикції яких входить дана метилірувана послідовність, перестають розщеплювати ДНК у цих сайтах. Аналогічний вплив на деякі рестриктази, наприклад, EcoRII, має і dcm-метилаза. ДНК-метилази бактеріальних систем рестрикції й модифікації (R-М-система) застосовують для блокування invitro відповідних сайтів рестрикції на фрагментах ДНК, що досліджуються з метою одержання під дією гомологічних рестриктаз фрагментів більших розмірів.

Лігази. У 1961 p. M. Мезельсон і Дж. Вейгл на прикладі фага показали, що рекомбінація включає розрив і наступне відновлення молекул ДНК. Ця робота доала імпульсу для пошуку ферментів, які беруть участь у процесі рекомбінації. Незабаром при дослідженнях фагів і Т4 було виявлено ферменти, що необхідні для здійснення фагових рекомбінацій. У 1967 р. незалежно у декількох лабораторіях було знайдено фермент, який називають ДНК-лігазою, що каталізує синтез фосфодіефірного зв'язку в дволанцюговій ДНК.

Створення фосфодіефірних зв'язків у одноланцюгових розривах дволанцюгової ДНК за допомогою ДНК-лігаз є, поряд з рестрикцією, одним із найважливіших етапів одержання рекомбінантних ДНК invitro. Найбільше застосування в генно-інженерних дослідженнях знаходить ДНК-лігаза бактеріофага Т4. Т4-ДНК-лігаза здійснює з'єднання фрагментів дволанцюгової ДНК, що мають комплементарні «липкі» або «тупі» кінці. З механізму реакції виходить, що необхідною умовою протікання лігирування є наявність 5'-кінцевого фосфату й 3'-кінцевого гідроксилу в точках розриву ланцюгів ДНК. При цьому ефективність з'єднання фрагментів ДНК по «тупих» кінцях Т4-ДНК-лігазою зростає за наявності Т4-РНК-лігази, що здійснює ковалентне з'єднання 5'-кінців одноланцюгових ДНК або РНК із 3'-кінцями одноланцюгових нуклеїнових кислот.

Лігирування «липких кінців»:

ДНК-лігаза фага Т4 забезпечує ковалентний зв'язок будь-яких дволанцюгових фрагментів ДНК, для яких є можливість стикувати 5'-і 3'- кінці. Тому вона є одним з найважливіших ферментів, на використанні яких засновані сучасні методи рекомбінації молекул ДНК invitro.

Зворотна транскриптаза (ревертаза). Під час досліджень інфекційних часточок вірусу саркоми Рауса було встановлено, що в них міститься фермент, аналогічний ДНК-полімеразі, але синтезуючий ДНК не на підставі ланцюга ДНК, а на ланцюга РНК. У цьому разі інформація передається у зворотному напрямку, тобто від РНК до ДНК.

Біологічна роль ревертази полягає в синтезі копій ДНК з геномів РНК у деяких РНК-вмістних вірусів. Віруси, спадкова інформація в яких закодована в РНК, але не в ДНК, мають назву ретровіруси. Зворотна транскриптаза в ретровірусах здатна синтезувати за матрицею РНК комплементарний до неї ланцюг ДНК, руйнувати саму РНК, а потім на підставі матриці ДНК синтезувати аналогічний вірусний РНК комплементарний ланцюг ДНК. Після цього здійснюється експресія гена, тобто транскрипція з ДНК на РНК і трансляція, під час якої створюються вірусні білки.

Таким чином, у ретровірусах передача генетичної інформації відбувається за схемою:

Зворотна

транскрипція Транскрипція Трансляція

Слід підкреслити, що процеси, які відбуваються у ретровірусах, не суперечать головній догмі молекулярної генетики, яка полягає в тому, що принципова схема передачі генетичної інформації здійснюється шляхом ДНК РНК білок, оскільки початкова РНК руйнується, а створення вірусних білків відповідає головній догмі.

Нуклеази − це гідролітичні ферменти, що розщеплюють нуклеїнові кислоти. За механізмом розщеплення субстратів нуклеази поділяють на екзо- і ендонуклеази. Екзонуклеази здійснюють послідовне відщеплення моно- або невеликих олігонуклеотидів з кінців молекул ДНК або РНК, у той час як ендонуклеази вносять у молекули нуклеїнових кислот внутрішні розриви. Зокрема, до ендонуклеаз належать численні рестриктази, які розглянуто вище. Деякі нуклеази мають більш широку специфічність і можуть гідролізувати як РНК, так і ДНК, а також одночасно виявляти ендо- і екзонуклеазну активності. Нуклеаза ВаlЗ1 з Alteramoniasaspejiana послідовно відщеплює окремі моно- і олігонуклеотиди з 5'- і 3'-кінців дволанцюгових ДНК, укорочуючи обидва ланцюги ДНК майже з однаковою швидкістю. При цьому нуклеаза ВаlЗІ гідролізує і одноланцюгові ДНК.

Екзонуклеаза III E. соli каталізує послідовне відщеплення 5'-нуклеотидів із дволанцюгових ДНК у напрямку 3' 5'.

Екзонуклеаза фага каталізує послідовне відщеплення 5'-мононуклеотидів у дволанцюгойих ДНК за наявності в них 5'-кінцевих фосфатних груп. її використовують для одержання одноланцюгових молекул ДНК з метою їх наступного секвенування.

Нуклеаза S1 з Aspergillusorizae специфічно розщеплює одноланцюгові молекули ДНК із утворенням 5'- фосфорильованих моно- і олігонуклеотидів.

Термінальна трансферази. У 1962 р. Ф. Боллум знайшов у тимусі теляти незвичайний фермент, який називають кінцевою дезоксинуклеотидилтрансферазою, або термінальною трансферазою. Даний фермент каталізує послідовне приєднання дезоксинуклеотидів до 3'-ОН-кінця молекули ДНК. Залежно від кофакторів (йонів Mg²⁺ або Co) термінальна трансфераза здатна приєднувати нуклеотиди як до одноланцюгової, так і дволанцюгової молекули ДНК по «липких» і навіть по «тупих» 3'-ОН-кінцях. За введення в реакцію, що регулюється термінальною трансферазою, дезоксинуклеотидів лише одного типу, наприклад, аденіну (А), створюються молекули ДНК, що містять гомополімерні одноланцюгові 3'-кінці − (роlуА-). Так само можливо добудувати іншим молекулам ДНК гомополімерні 3'-кінці, що комплементарні першим, наприклад, тиміну (Т), з утворенням (polyT-). Змішування одержаних препаратів ДНК за певних умов може приводити до формування гібридних молекул ДНК. Саме за допомогою кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферази у 1972 р. було здійснено перший експеримент з рекомбінації молекул ДНК invitro.

Дата добавления: 2017-02-01