Характеристика клітин, що культивуються іп virto

Клітини одного й того типу в тканині взаємодіють одна з одною і узгоджують швидкість розподілу, щоб підтримувати належну щільність популяції. «Соціальний» контроль такого роду чітко проявляється за реакцій на пошкодження. Наприклад, при пошкодженні епітелію, клітини по краях рани стимулюються до розподілу й наповзання на оголену поверхню, поки вона знову не буде закрита; у цей момент швидка проліферація і рух клітин припиняються. Подібне явище можна спостерігати на дисоційованих клітинах у культурі. Епітеліальні клітини або фібробласти, поміщені в чашку, за наявності сироватки будуть «приклеюватися» до поверхні, розпластуватися й розподілятися, поки не утвориться суцільний моношар, у якому сусідні клітини стикаються.

Коли культура стане моношаровою, рух клітин припиняється. Нормальні клітини перестають розподілятися, це явище відомо як гальмування проліферації, що залежить від щільності. Якщо такий моношар «поранити» голкою таким чином, щоб на чашці утворилася вільна від клітин смужка, клітини із країв цієї смужки починають просуватися на вільне місце й розподілятися.

Поведінка клітин у культурі характеризується двома основними параметрами: контактним гальмуванням і адгезією.

Контактне гальмування − або регуляція клітинного росту, залежить від кількості клітин на одиниці площі. Максимальна щільність для нормальних клітин - 10⁴/см², для пухлинних клітин -10 /см. Нормальні клітини, що ростуть на поверхні субстрату, створюють моношар, а ріст пухлинних клітин характеризується безладністю у зв'язку з чим утворюється багатошарова структура.

Адгезія, тобто з'єднання клітин між собою і субстратом, що пригнічує процеси росту клітин, у пухлинних клітин виражена значно менше, ніж у клітини з нормальною програмою розвитку.

Меншу здатність до адгезії і нижчу ступінь контактного гальмування пухлинних клітин, в першу чергу, пов'язують з нерівномірним розташуванням на їх поверхні рецепторів, які реагують на мітогени- речовини, що прискорюють подвоєння клітин і халогени - речовини, що затримують процес подвоєння. Таким чином, пухлинні клітини зберігають здатність до тривалого розмноження в культурі.

Щільність клітинної популяції, за якої клітини в суцільному моношарі перестають розполятися, збільшується з підвищенням концентрації факторів росту в середовищі. Крім того, виявилося, якщо культуральна рідина буде протікати по поверхні чашки з острівцями клітин, то клітини, що омиваються середовищем, яке щойно пройшло над іншими клітинами, будуть розподілятися повільніше за ті, які обмиваються середовищем, що пройшло над вільними від клітин ділянками. У середовищі, що протікало над клітинами, можливо бракує поживних речовин або факторів росту.

Фактор росту, звичайно, присутній у середовищі в концентрації до 10"¹ М (приблизно одна молекула в об'ємі сфери діаметром З мкм). Один фібробласт має до 10⁵ рецепторів фактора росту, кожний з яких високоспоріднений до нього. Таким чином, у кожної клітини досить рецепторів, щоб зв'язати всі молекули ростових факторів в об'ємі сфери діаметром близько 150 мкм.

Крім того, вважають, що значна частина фактора росту, пов'язаного рецепторами клітинної поверхні, швидко поглинається шляхом ендоцитозу й руйнується. Із цього зрозуміло, що сусідні клітини конкурують між собою за навіть незначної кількості факторів росту. Такого роду конкуренція важлива як для клітин у тканині, так і для клітин, Що культивуються, вона запобігає росту популяції вище певного рівня її щільності.

Конкуренція за фактори росту й поживної речовини не єдинийфактор, що впливає на швидкість розподілу в клітинній культурі. Форма клітин під час їх розпластування і руху по поверхні субстрату на вільні місця теж дуже впливає на їхню здатність розподілятися. За культивування нормальних клітин у суспензії, коли вони не прикріплені до твердої поверхні й тому мають округлу форму, процес розподілу не відбувається (залежність розподілу від прикріплення). Вплив розпластування клітин на проліферацію можна продемонструвати за вирощування клітин на субстратах з різною адгезивністю поверхні або на таких субстратах, де є лише дрібні адгезивні ділянки, на яких клітина може прикріпитися, але не може розпластатися. Частота розподілу клітин зростає зі збільшенням ступеня розпластування. Можливо, що сильно розпластані клітини можуть уловлювати більше молекул фактора росту й поглинати більше поживних речовин завдяки своїй більшій поверхні.

Однак, деякі типи клітин, що майже не здатні до проліферації в суспензії, охоче розподіляються, як тільки їм вдається вступити в контакт із ділянкою субстрату, навіть, якщо ця ділянка настільки мала, що клітина не може на ній розпластатися. Цикл прикріплення й відкріплення, імовірно, дозволяє перегрупувати адгезивні контакти як між клітинами, так і між клітинами й матриксом, щоб вмонтувати знову виниклі дочірні клітини в тканину, перед тим як вони зможуть почати наступний цикл розподілу. Ослаблення контактів, очевидно, становить важливу особливість проліферативної поведінки більшості типів клітин. Наприклад, у ранній стадії реакції фібробластів на ростовий фактор відбувається руйнування їхніх фокальних контактів. Втрата керованості росту в ракових клітин майже завжди пов'язана з незворотним зменшенням клітинної адгезивності, що проявляється також у втраті фокальних контактів за вирощування таких клітин у культурі.

Зміна ростових властивостей клітин, що культивуються, називається трансформацією. Трансформація - процес незворотний і, мабуть, включає генетичні зміни. Зміна ростових властивостей є однією з адаптивних особливостей, що дозволяє клітинам проліферувати в умовах, несприятливих для нетрансформованих клітин. У такий спосіб в умовах, які обмежують ріст нормальних клітин, трансформовані клітини будуть рости до більш високої щільності популяції, що, очевидно, буде пов'язано з їхньою зниженою потребою у факторах росту. Є докази, що основна зміна за трансформації пов'язана зі зміною транспортування поживних речовин через клітинну мембрану, а це, у свою чергу, може зробити клітини менш залежними від геометричних факторів росту.

Трансформовані клітини здатні рости в умовах, в яких геометричні характеристики, а саме, відношення площі поверхні до об'єму менш сприятливі. Отже, трансформовані клітини будуть рости в суспензійних культурах, утворюючи сферичні клони. Так, трансформовані клітини за введення іммунологічно толерантній тварині у відносно невеликих кількостях, можуть утворювати пухлини. Із цієї причини трансформація іноді прирівнюється до злоякісних змін. Трансформація може бути або вірусною, або спонтанною. Більшість досліджень виконані із клітинами, що піддаються вірусній трансформації. Коли при цьому використовували добре відомі віруси, що трансформують, такі, як віруси SV40 і поліоми, то властивості трансформованих клітин виявлялися дуже чітко і були описані детально. Аналогічні зміни, що спостерігалися після спонтанної трансформації, призвели до припущення, що така трансформація є результатом активації послідовностей генів (онкогенів), що вже були присутні у геномі трансформованої до цього клітини, подібної до такої у вірусному геномі. Багато досліджень підтвердили, що спонтанно трансформовані клітини мають таку ж послідовність основ у ДНК, як і в клітинах, трансформованих вірусами.

Старіння характерне для клітин, що мають обмежений потенціал проліферації, тобто низьку щільність насичення за ідеальних умов культивування. Прикладом можуть бути лінії диплоїдних клітин людини. Підвищена здатність до росту трансформованих клітин означає, що трансформація переважає над процесом старіння.

Старіння, безумовно, залежить від генетичних факторів, тому що кожний вид має характерну тривалість життя, але варіабельність усередині популяцій за цим показником свідчить також про вплив фенотипу. За адаптування диплоїдних клітин людини (лінія РР738) вже із самого початку було показано, що клітини, які культивуються, можуть виявляти феномен старіння й мають обмежений час життя (50±10 подвоєнь популяції). Залежні від віку зміни, що при цьому спостерігалися, включали подовження міжмітотичних інтервалів (19±25% - 31±41%/год.), зміну метаболізму, рівнів ферментів і експресії продукту. Слід зазначити, що не встановлено чіткого зв'язку між тривалістю життя залежно від походження клітини (миша, людина) і потенціалом подвоєння їх клітин у культурі.

Межа або ліміт Хейфліка (англ. Науflicklітіt) − межа розподілу соматичних клітин, названа на честь її відкривача Л. Хейфліка. У 1965 році Хейфлік спостерігав, як клітини людини, що подвоюються в клітинній культурі, гинуть приблизно після 50 подвоєнь і проявляють ознаки старіння за наближення до цієї межі.

Такий ліміт був знайдений у культурах усіх цілком диференційованих клітин як людини, так й інших багатоклітинних організмів. Максимальне число подвоєнь залежить від типу клітин і ще більше розрізняється залежно від організму. Для більшості клітин людини межа Хейфліка дорівнює 52 подвоєнням.

Межа Хейфліка пов'язана зі скороченням теломер, ділянок ДНК на кінцях хромосом. Переважна більшість соматичних клітин не мають активної теломерази, і тому при кожному подвоєнні клітини теломери скорочуються, оскільки ДНК-полімераза не здатна реплікувати кінці молекули ДНК (можливо, теломери інколи скорочуються під впливом деяких інших факторів). Коли після певного числа подвоєнь теломери зникають зовсім, клітина зазвичай стає заблокованою на певній стадії клітинного циклу або запускає програму апоптозу, тобто самогубства.

Для пояснення старіння і загибелі клітин запропоновано декілька гіпотез. Одна з них пов'язує старіння з накопиченням соматичних мутацій, порушенням процесів транскрипції і трансляції, біосинтезом у зв'язку з цим значної кількості неактивних або частково активних молекул, що викликає збільшення аномальних продуктів обміну. Однак є дані, що віруси у старих і молодих клітинних культурах розмножуються однаково успішно, тобто, апарат біосинтезу білка клітини-господаря, який бере участь у процесі репродукції вірусів функціонує однаково добре як у старих, так і в молодих клітинах.

Друга гіпотеза − гіпотеза запрограмованої загибелі клітин припускає, що смерть клітин − це результат реалізації генетичної програми. Існують експериментальні дані, які підтверджують, що загибель клітин у культурі та організмі настає після числа подвоєнь, що збігається, і є наслідком реалізації генетичної програми.

Ще одна з гіпотез пояснює загибель клітин накопиченням речовини - липофусцину, яка утворюється в результаті розпаду білкових структур, ліпідів і гему. За подвоювання клітин, липофусцин, що накопичується, розподіляється між дочірніми клітинами. Однак не зрозуміло, чому липофусцин не впливає наттривалість життя в культурі пухлинних клітин?

Обмежені за тривалістю життя клітинні лінії, наприклад, лінії диплоїдних клітин фібробластів, не є ідеальними об'єктами для цілей виробництва, оскільки їх повинні використовувати до того, як у клітинах відбудуться серйозні зміни старіння. З практичної точки зору це означає, що період життя цих клітин, коли їх можна застосовувати з метою виробництва, коливається між 12 і 30 пасажами (у першому випадку − для приготування посівного матеріалу). Трансформовані ж клітини не мають обмеженої тривалості життя, крім того, субстрати з них характеризуються більш високою щільністю популяції клітин, значними швидкостями росту й здатністю рости в суспензіях. Усе це обумовлює їхню перевагу в біотехнології для використання як субстратів для генерації різних продуктів.

Дата добавления: 2017-02-01