Отримання і застосування ферментів

ІНЖЕНЕРНА ЕНЗИМОЛОГІЯ

РОЗДІЛ 8

Інженерна ензимологія

РОЗДІЛ 8.

8.1. Отримання і застосування ферментів

8.2. Іммобілізовані ферменти

8.2.1. Процеси на основі іммобілізованих ферментів

8.2.2. Іммобілізовані ферменти в харчовій промисловості

8.3. Біотехнологія отримання молочних продуктів

8.4. Біотехнологія отримання змінених продуктів харчування

Контрольні запитання

Наприкінці 60-х − початку 70-х pp. на базі технічної біохімії, хімічної технології, хімічної ензимології і ряду інженерних дисциплін виник новий науково-технічний напрям біотехнології − інженерна ензимологія, до якої відносять систему методів отримання, очищення, стабілізації і застосування ферментів. Основним завданням інженерної ензимології є конструювання біоорганічних каталізаторів із заданими властивостями на основі ферментів або ферментних комплексів та розробка на їх базі різних ефективних і екологічно чистих біотехнологічних процесів. Висока субстратна специфічність ферментативного каталізу та унікальна здатність прискорювати реакції в десятки і сотні разів в умовах нормального тиску і фізіологічних температур дозволяють одержувати високі виходи продуктів та створювати практично безвідходні біотехнологічні процеси, що не забруднюють навколишнє середовище.

Ефективні біотехнологічні процеси на основі ферментативного каталізу використовуються все ширше в різних сферах людської діяльності: харчовій промисловості, енергетиці, медицині, біоелектрокаталізі і мікроелектроніці.

Ферменти − це специфічні каталізатори білкової природи, що виробляються клітинами і тканинами організмів. Вони здатні у багато разів прискорювати перебіг хімічних і біохімічних реакцій, не входячи до складу кінцевих продуктів. Практичні застосування ферментів засновані на їх високій каталітичній активності і вищою порівняно з небіологічними каталітичними системами субстратною специфічністю.

Джерелом ферментів є рослинні і тваринні тканини, мікроорганізми. Хімічний синтез ферментів у промислових масштабах дуже складний, дорогий і економічно недоцільний.

Мікробіологічний метод отримання ферменті − найбільш перспективний. Наведемо його переваги:

1. багатство асортименту ферментів, що синтезуються мікроорганізмами;

2. можливість управління ферментативними системами і складом вироблюваних препаратів;

3. висока швидкість розмноження мікроорганізмів і можливість використання різних, у тому числі доступних і недорогих субстратів.

Ферменти в мікробних клітинах можуть мати як внутріклітинну локалізацію, так і виділятися в навколишнє середовище. Останні доступніші для препаративного отримання, тому в промислових масштабах виготовляють головним чином позаклітинні ферменти. Із описаних до теперішнього часу понад 2000 ферментів практичне значення мають близько 50.

За сучасною класифікацією всі ферменти підрозділяються на 6 класів: оксидоредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази і лінази (синтетази). Негідролітичні ферменти − оксидоредуктази, ліази, ізомерази і лінази застосовуються порівняно рідко. Найбільш широке застосування дістали мікробні гідролази, що взаємодіють з пептидами, глікозидами й іншими сполуками за участю води. Серед гідролаз − глікозидази, протеїнази, ліпази. Глікозидази каталізують гідроліз глікозидних сполук. Так, крохмаль гідролізують амілази, продуцентами яких є різні мікроорганізми (Bacillus, Aspergillus); декстраназа, що взаємодіє з глікозидними зв'язками декстрана, синтезується Penicilliumpurpurogenium; пулоназа, гідролізуюча глікоген, декстрин, продукується бактеріями Klebsiella; інвертаза синтезується багатьма представниками роду Aspergillus; целюлолітичні ферменти, що є складним комплексом активних білків, впливають на різні ділянки молекули целюлози. Фітопатогенні гриби Fusariumoxysporum, Erwinia утворюють пектинолітичні ферменти; анаеробні бактерії Clostridiumfelsineum продукують полігалактуроназу, пектинестеразу. Дуже різноманітні протеїнази, що каталізують розрив пептидних зв'язків білків з утворенням пептидів і вільних амінокислот. Протеїнази різних мікроорганізмів суттєво розрізняються своїми властивостями; серед продуцентів протеїназ − Aspergillus, Actinomyces, Clostridium, E.coli. Продуцентами ліпаз, що здійснюють гідроліз триацилгліцеролів з утворенням жирних кислот і гліцерину, є різні мікроорганізми (Aspergillus, Mucor, Rhizopus,Geotrichum, Candida). Фосфокінази, що синтезуються бактеріями Clostridium, Bacillus, розщеплюють складні зв'язки між жирними кислотами, гліцерином і фосфатидною кислотою.

Історія застосування ферментів сягає корінням в далеке минуле. Деякі ферменти, що містяться в природних рослинних матеріалах, здавна використовувалися людиною для отримання пива, спиртних напоїв, виробництва хліба і кисломолочних продуктів. Практика, заснована на колективному досвіді людей, набагато випередила розробку наукових основ для створення даних технологічних процесів. Промислова галузь отримання ферментних препаратів з природної рослинної сировини почала зароджуватися лише наприкінці XIX ст., а ера сучасної інженерної ензимології налічує близько 40 років. Проте, ферменти настільки увійшли в наше життя і широко застосовуються в різних промислових галузях, що уявити без них наше існування сьогодні ми не можемо. Промислове отримання і застосування ферментів в різних технологічних процесах складає нині один з найважливіших розділів новітньої біотехнології.

Величезне значення ферменти мають у різних галузях харчової промисловості. У хлібопеченні амілази прискорюють процес дозрівання і покращують якість тіста; їх використовують також для отримання розчинного крохмалю, патоки, декстрину. Грибні амілази замінюють солод, лактазу використовують для видалення молочного цукру із молока; інвертази цукрів, що запобігають кристалізації сахарози, застосовують у кондитерській промисловості. Комплекс ферментів − цитаз, використовують для повнішої екстракції соків з плодів і овочів, а також отримання ефірних масел. Грибні глюкозидази, звільняють продукти від залишкових цукрів, подовжують терміни їх зберігання. За допомогою каталази з продуктів видаляють перекиси водню, целюлази застосовують для оцукрування крохмалю з картоплі і зерна, а також збільшення виходу агар-агару з водоростей. Протеолітичні ферменти мікробного походження замінюють ренін в сироварінні. Ліпази знаходять застосування у виробництві сухого молока і для прискорення дозрівання сирів. Пектинолітичні ферменти здавна застосовуються для обробки льоносоломи і одержання з неї волокна. Амілолітичні ферменти використовують для видалення клею з тканин; деякі протеїнази застосовують для вивільнення шовкових волокон з шовку-сирцю; для знежирення волокон використовують ліпази. У шкіряній промисловості за допомогою протеолітичних ферментів проводять зневолошення шкур і розм'якшення голини, прискорюють також процеси отримання високоякісної шерсті. Ферментні препарати застосовують у сільському господарстві за виробництва кормів. Пектинази і геміцелюлази підвищують доступність і засвоюваність кормів, прискорюють процеси силосування зелених кормів, що важко або зовсім не силосуються.

Все більшого застосування ферменти знаходять в тонкому органічному синтезі, в процесах отримання різних складних сполук (амінокислот, пептидів, нуклеотидів, напівсинтетичних антибіотиків), а також в медицині. Ряд ферментів застосовують у так званій «замінній терапії» для заповнення наявного ферментативного дефіциту. Так, препарати протеїназ використовують для видалення некротичних тканин під час лікування гнійних ран і опіків. Бактерійну аспарагіназу, що розщеплює аспарагін, необхідний лейкозним клітинам, застосовують при деяких злоякісних захворюваннях. Препарати протеїназ (терилін і стрептокіназа) володіють тромболітичною дією і застосовуються для боротьби з тромбозами. Холестерінестераза гідролізує холестерин,локалізований на внутрішніх стінках кровоносних судин.

Таким чином, обсяги і спектр ферментів, що випускаються, а також сфери їх застосування розширюються з кожним роком. Мікроорганізми, що є джерелом для отримання різноманітних ферментів, істотно розрізняються між собою за здатністю синтезувати дані біологічно активні сполуки. Ці відмінності виявляються як в асортименті ферментів, що синтезуються тим або іншим видом мікробів, так і в їх активності та вихідних властивостях. Ферменти − речовини білкової природи, тому в суміші з іншими білками визначити їх неможливо. Наявність ферменту визначають за протіканням тієї реакції, яку каталізує фермент; кількісне визначення ферменту проводять за величиною продукту реакції, що утворився, або за витратами вихідного субстрату. Прийнята так звана стандартна одиниця активності (Е або U) − це кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мікромоля субстрату за хвилину при заданих стандартних умовах.

Вибір продуцента необхідного ферменту пов'язаний з перевіркою активності величезної кількості культур, що приводить до відбору найбільш активного продуцента. Природні штами зазвичай не синтезують ферменти у надлишкових кількостях, оскільки процес їхнього синтезу перебуває під суворим генетичним контролем. Виняток становлять конститутивні ферменти, наприклад, ферменти гексозомонофосфатного шляху, що синтезуються у великих кількостях за будь-яких умов росту.

Вихід ферментів можливо збільшити також за допомогою новітніх методів біотехнології. За допомогою плазмід або фагів, здатних до трансдукції, дозволяється збільшити копійність генів, що кодують синтез цільових ферментів. Посилення експресії генів можливе також в результаті включення сильних промоторів у ДНК.

Окрім генетичного фактора, величезний вплив на продукцію ферментів мають склад середовища і умови культивування мікроорганізмів. При цьому не лише наявність індуктора в середовищі здатна збільшити вихід ферменту. Надзвичайно важливим є якісний і кількісний склад поживного середовища. Наприклад, більшість видів цвілевих грибів роду Aspergillus добре ростуть на досить простому синтетичному середовищі Чапека з сахарозою і нітратом. Для синтезу амілази, однак, сахарозу слід замінити крохмалем і збільшити концентрацію вуглецю і азоту в середовищі. Після цього активність ферменту зростає в 3 рази. Додавання амінокислот у вигляді екстракту солодових ростків підвищує вихід ферменту додатково в 4...5 разів. Оптимізуючи склад поживного середовища, можна підвищити активність амілази більш ніж у 500 разів.

Підбираючи склад середовища, враховують всі фактори: вид і концентрацію джерела вуглецю та енергії, фактори росту, мінеральні елементи, що індукують субстрати. Як джерела вуглецю і азоту найчастіше застосовують різну природну органічну сировину: крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати дріжджових біомас. Окрім джерела вуглецю, азоту і факторів росту, великий вплив на синтез ферментів роблять мінеральні солі магнію, марганцю, кальцію, заліза, цинку, міді й ін., багато з яких входять до складу ферментів.

Біотехнологічне виробництво ферментів реалізується двома способами − поверхневим і глибинним. Твердофазна поверхнева ферментація полягає у вирощуванні продуцента на поверхні тонкого шару твердого сипкого середовища. Глибинна ферментація у рідкому середовищі може бути реалізована як в умовах періодичного процесу, так і із застосуванням проточних систем.

При поверхневій ферментації для отримання інокуляту споровий матеріал розмножують поверхневим способом або вирощують музейну культуру в умовах глибинної рідкої культури. У подальшому посівний матеріал направляють у стадію ферментації, яка здійснюється на поверхні сипкого середовища в металевих лотках або вертикальних перфорованих з обох боків кюветах. Культура розвивається на поверхні твердого крихкого середовища, основу якого складають пшеничні висівки, зернове лушпиння, що є джерелом ростових речовин. Для розпушування середовища у висівки додають деревну тирсу (5... 10%), вівсяне лушпиння. Суміш перед автоклавуванням зволожують до 20...40% вологості і підкисляють для поліпшення умов стерилізації. Прогрівання сипкого середовища здійснюють парою в спеціальних стерилізаторах за безперервного перемішування середовища; тривалість процесу -60...90 хвилин за температури 105...140°С. У охолоджене до температури 30°С середовище вносять стерильні термолабільні компоненти, інокулят (0,02...0,10% від маси середовища), швидко перемішують ручним способом і розкладають у лотки шаром 2...З см, які встановлюють в герметичні заздалегідь простерилізовані камери, що підлягають аерації. Початкова вологість середовища − 58...60%, температура культивування 28...32°С, тривалість ферментації близько 36...48 год.

Поверхнева ферментація є екстенсивним методом з великою часткою ручної праці. При цьому, однак, він не енергоємний і забезпечує вищий вихід продукту на одиницю маси середовища порівняно з глибинною ферментацією.

Поверхнева ферментація з використанням замість лотків кювет досконаліша. Конструкція забезпечує ефективнішу аерацію і дозволяє частково механізувати процес (рис. 68). Використання в промисловості колонних апаратів об'ємної аерації ще більше вдосконалює процес твердофазної ферментації. Такий апарат розподілений на секції перфорованими пластинами, закріпленими на поворотних осях. Середовище в ході ферментації розпушується за допомогою перемішуючих пристроїв. Це дозволяє збільшити висоту шару до 30 см. Режим перевантаження середовища на тарілках задається автоматично. Продуктивність апарату досягає 1 т культури за добу.

Глибинний спосіб мікробіологічного отримання ферментів має переваги порівняно з поверхневим, оскільки проходить у контрольованих умовах ферментації, виключає ручну працю, дозволяє автоматизувати процес. Поживне середовище для готується, виходячи з фізіологічних потреб мікробної культури, що використовується, а також з типу цільового ферменту. Основною вуглецевою сировиною є різні сорти крохмалю (кукурудзяний, пшеничний, картопляний), кукурудзяний екстракт, буряковий жом, а також глюкоза, мальтоза, декстрин. Як джерело азоту застосовують органічні сполуки (гідролізати казеїну або мікробних біомас),_д а також мінеральні солі (NaNC>3, NH4NO3, (NH₄)2HP0₄, (NH₄)2S0₄). Для біосинтезу целюлолітичних ферментів джерелом вуглецю є бавовна, солома, целюлоза; ліполітичних − ліпіди.

Процес проводять у циліндрових апаратах об'ємом до 100 м. Синтез ферменту в глибинній культурі протікає протягом 3...4 діб за безперервної подачі стерильного повітря, стабілізації рН і температури середовища у суворо визначених рівнях. Незначні зміни значень даних параметрів можуть викликати багаторазове зниження ферментативної активності.

Рис. 68. Схема отримання технічних ферментних препаратів методом поверхневого культивування:

I - елеватор - автоматичні ваги, 3 - бункер, 4 - стерилізатор, 5 - резервуар для стерильної води, 6 - пульт розподілу, 7 - полиці, 8 - камера, 9 - кондиціонер, 10 - дробарка,

II - дезінтегратор, 12 - сушарка, 13 - шнек, 14 - ваги, 15 - калорифер, 16 і 17 - вентилятори, 18 - циклон, 19 – мийка для кювет, 20 - стерилізатор для кювет

Процес утворення біомаси продуцента не збігається в часі з максимумом продукції ферменту, при цьому умови для утворення ферменту можуть суттєво відрізнятися від умов для оптимального режиму синтезу біомаси. Тому умови середовища в процесі протікання ферментації контролюються і змінюються. Відомі стадійні процеси в двох послідовних апаратах. У першому створюють умови для розвитку міцелію; у другому − для синтезу і накопиченняферменту.

Ряд ферментних препаратів, що отримуються за поверхневої ферментації, випускають у вигляді висушених висівок із залишками міцелію, а також висушених осадів білків або висушених розчинів. Товарні форми таких препаратів відомі у вигляді сухих препаратів або розчинів ферментів. Останні зберігають за мінусової температури, із застосуванням стабілізаторів (солі кальцію або магнію, а також хлорид натрію, сорбіт й ін.). Для отримання очищених препаратів ферментів застосовують різні методи (осадження солями або органічними розчинниками, висолювання, сорбційне і хроматографічне очищення з використанням високоселективних іонітів). Процес завершується стадією висушування на розпилювальних або вакуумних апаратах в щадному температурному режимі, що не допускає великих втрат активності ферментів. Після стандартизації продукт надходить споживачеві.

Дата добавления: 2017-02-01