Theory of fluorescence

A) Флуоресцентные преобразователи

Биолюминометрические

В данном подразделе речь идет о физических основах и средствах измерения люминесценции.

Энергия возбужденного атома (молекулы) может принимать лишь определенный и характерный для данного атома дискретный ряд значений. При переходе с более высокого энергетического уровня Q_M на более низкий Q_N атом (молекула) излучает квант с длиной волны l _MN:

Q_M – Q_N = hc /l _MN,

где h – постоянная Планка = 6,626·10^–34 Дж·с; с – скорость света = 3 ·10⁸ м/c.

Спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждения, поэтому он характеризует исследуемое вещество. Кратковременная люминесценция называется флуоресценцией, долговременная – фосфоресценцией.

Оptical biosensors are mainly based on changes in absorbance or fluorescence of an appropriate indicator compound and do not need a total internal reflection geometry. For example, a fully operational prototype device detecting casein in milk has been fabricated. The device is based on detecting changes in absorption of a gold layer. A widely used research tool, the micro-array, can also be considered a biosensor.

Флуоресцентный глюкозный биосенсор. Fluorescent glucose biosensors are devices that measure the concentration of glucose in diabetic patients by means of sensitive protein that relays the concentration by means of fluorescence, an alternative to amperometric sension of glucose. No device has yet entered the medical market, but, due to the prevalence of diabetes, it is the prime drive in the construction of fluorescent biosensors.

Fluorescence is a property present in certain molecules, called fluorophores, in which they emit a photon shortly after absorbing one with a higher energy wavelength.

To be more specific, in order for an electron in the outer orbital of a molecule to jump from a ground-state orbital to an exited state orbital, it requires a fixed amount of energy, which, in the case of chromophores (molecules that absorb light), can be acquired by absorbing a photon with an energy equal or slightly higher. This state is short-lived, and the electron returns to the ground-level orbital, losing the energy either as heat or in the case of fluorophores by emitting a photon, which, due to the loss of the difference between the energy of the absorbed photon and the excitation energy required, will have a lower energy than the absorbed photon, or, expressed in terms of wavelength, the emitted photon will have a longer wavelength. The difference between the two wavelengths is called Stokes’ shift.

This property can be found in quantum dots, certain lanthanides and certain organic molecules with delocalized electrons.

These excited molecules have an increase in dipole momentum and in some cases can undergo internal charge rearrangement. When they possess an electron withdrawing group and an electron donating group at opposite ends of the resonance structure, they have a large shift in charge distribution across the molecule, which causes the solvent molecules to reorient to a less energetic arrangement, called solvent relaxation. By doing so, the energy of the exited state decreases, and the extent of the difference in energy depends on the polarity of the solvent surrounding the molecule.

An alternative approach is to use solvatochromic dyes, which change their proprieties (intensity, half-life, and excitation, and emission spectra), depending on the polarity and charge of their environments. Hence, they are sometimes loosely referred to as environmentally sensitive dyes. These can be positioned on specific residues that either change their spatial arrangement due to a conformational change induced by glucose or reside in the glucose-binding pocket whereby the displacement of the water present by glucose decreases the polarity.

An additional property of fluorescence that has found a large usage is Förster resonance energy transfer (Fret) in which the energy of the excited electron of one fluorophore, called the donor, is passed on to a nearby acceptor dye, either a dark-quencher (non-emitting chromophore) or another fluorophore, which has an excitation spectrum that overlaps with the emission spectrum of the donor dye, resulting in a reduced fluorescence.

For sensing purposes, this property is, in general, used either in combination with a biomolecule, such as a protein, which undergoes a conformational change upon ligand binding, changing the distance between the two labels on this protein, or in a competition assay, in which the analyte has to compete with a known concentration of a fixed labelled ligand for the labelled binding site of protein. Therefore, the Fretbetween the binding site and the competing ligand decreases when the analyte concentration is increased. In general, the competing ligand in the case of glucose is dextran, a long glucose polymer attached to the scaffolding or to the enzyme.

(2б) Собственно люминометрические преобразователи

Сверхслабая люминесценция БО может усиливаться в присутствии физических или химических веществ- активаторов. Химические активаторы вступают в реакции с органическим веществом, способствуя образованию новых возбужденных молекул, испускающих излучение. Физические активаторы увеличивают величину квантового выхода возбужденной молекулы с сотых долей процентов до единиц процентов и более.

ИПдля контроля хемо люминесценциине требует возбуждения БО потоком энергии. Для выделения длины волны люминесценции световой поток, излучаемый БО, пропускают через светофильтр и измеряют чувствительными фотоприемниками малых потоков (вакуумными фотоэлектронными умножителями,полупроводниковыми фотодиодами).

ИП для контроля фото люминесценции включает источник возбуждающего излучения, БО, светофильтр для пропускания люминесценции и фотоприемник. Под действием возбуждающего излучения возникает свечение БО, которое выделяется светофильтром и измеряется фотоприемником.

ИП для контроля замедленной флуоресценции включает: источник освещения с короткими длинами волн; систему оптических затворов; блок для помещения БО; чувствительный фотоприемник, улавливающий излучение в красной области спектра. БО возбуждается источником освещения, поток которого отсекается затвором, после чего измеряется свечение БО.

Следует учитывать, что помимо БО люминесценцией обладают многие вещества: стекло, бумага, картон, текстолит, пластмассы, дерево и др., поэтому при измерениях следует учитывать эффект фоновой люминесценции от вспомогательных материалов.

На основе люминесцентного ИП разработаны различные БСС медицинского и экологического назначения.

а) Оптоды. Современные биотехнологии позволяют иммобилизовывать фермент с активатором люминесценции на одном торце волоконно-оптического световода и измерять свечение фотоприемником, присоединенным к другому торцу. Такие БСС с БХП на основе ферментов получили название оптодов. Первые ферментные оптоды были разработаны еще в 1975 г. для измерения O₂ как фактора, вызывающего биолюминесценцию люциферина. В настоящее время созданы оптоды для обнаружения, помимо О₂, ботулиновых токсинов в пище, кофакторов ферментов (НАДФ), аминокислот, глюкозы, ионов тяжелых металлов, антител.

б) Приборы для оценки токсичности воды и почвы. Фирмами Beckman и Microbics на базе люминесцентного ИП спроектирована БСС «Microtox», в которой для оценки загрязнения воды применен БХП со светящимися морскими бактериями. Их люминесценция подавляется токсичными веществами.

В Германии фирмами Carl Ceiss и «DrLANGE» разработана близкая по принципу действия БСС «LUMIStox» для контроля загрязнения почв с БХП на основе люминесцентных морских бактерий.

В России для экологических целей на базе люминесцентного ИП были выпущены БСС:

· «Аналитическая система для интегральной оценки состояния среды обитания человека» с ферментным БХП на основе реакции люциферин- люцифер аза

· «Биолюм» с БХП на основе полученных методами генной инженерии

· пресноводными светящимися бактериями.

в) Экологические биофлуориметры. В экологической практике для измерения с помощью флуоресцентного ИП послесвечения хлорофилла- a используют компьютерно-управляемую БСС «Фотон-7-1» с БХП на основе фотосинтезирующих пигментов.

Дата добавления: 2014-01-04