Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Культуры

Исследователи делят каллусные ткани на типы по таким морфологическим признакам, как цвет, консистенция, характер поверхности, опушение, а также по интенсивности роста и способности к зеленению. Цвет каллусной ткани может быть беловатым, желтоватым, бурым, коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофиллом или антоцианом. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают компактными и плотными или рыхлыми и оводненными, распадающимися при извлечении каллуса на отдельные кусочки.


Под понятием «происхождение каллусной ткани» подразумевают видовое, органное, тканевое происхождение. Возникшая каллусная ткань будет отличаться в зависимости от вида растения, его физиологического состояния в момент изолирования экспланта для культивирования. Кроме того, органы или их фрагменты представляют собой «мозаику» тканей с клетками различной дифференциации, которые не все переходят к делению. Образование каллуса происходит в области первичных или вторичных меристем, а также из паренхимы (основная ткань, внутри которой дифференцируются высокоспециализированные (проводящие, механические) ткани), прилегающей к этим меристемам или к вторичным сосудистым тканям. Этот процесс зависит также от размера экспланта и составляющих клеток. Чем крупнее эксплант, тем более сложен и разнообразен набор клеток. Быстрее образуют каллус молодые ткани, чем зрелые, поэтому чаще для получения каллуса используют ткани и органы проростков. Многие ткани обладают физиологической полярностью. Например, на фрагментах стебля каллус более интенсивно образуется на той стороне экспланта, которая на растении обращена к корню, поэтому экспланты помещают на агар апикальной (верхушечной, конечной) стороной.

Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая их на свежую питательную среду. Каллусные культуры выращивают в чашках Петри, пробирках, колбах, флаконах. Каллусную ткань через 3-4 недели роста извлекают, нарезают на кусочки и пассируют (пересаживают) на свежую питательную среду, потому что ухудшаются питание и аэрация внутренних участков ткани, истощается питательная среда. Состав новой среды определяется целями эксперимента. Если нужно только поддерживать рост каллуса, то среда остается прежней.

В некоторых случаях, учитывая взаимодействие клеток между собой, применяют специальные методы выращивания каллуса. Так метод культуры «няньки», или «кормящего слоя», используется для стимуляции роста одного каллуса другим. При этом ткань пересаживается на фильтровальную бумагу, смоченную средой, и помещается на хорошо растущую клеточную массу того же вида растений. Иногда в одном культивируемом сосуде совместно выращивают ткани разных видов растений. В отдельных случаях прибегают к прививке тканей либо органа на ткань. Какие-то вещества, выделяемые хорошо растущими тканями или органами, стимулируют рост опытной каллусной ткани. Таким образом, основным типом культивируемых клеток всех высших растений являются каллусные клетки. Техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых клеток интактного растения.

Широкое культивирование каллусных тканей обусловлено их способностью к различным типам морфогенеза. Изменяя состав питательной среды, можно добиться того, что неорганизованно растущая каллусная ткань вновь вернется к эмбриональному состоянию и даст начало растению-регенеранту. Следовательно, можно получить целое растение даже из одной клетки, в этом проявляется уникальное свойство растительной клетки – тотипотентность.

3 Культуру клеток растений, выращиваемую в жидкой среде, называют суспензионной культурой. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают разными аппаратами. Аэрация клеток обеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды, либо путем продувания жидкой среды стерильным воздухом. В отдельных экспериментах инкубируемые клетки не бывают погружены в питательную среду постоянно, а попеременно контактируют с жидкой средой и воздухом. В этом случае газообмен существенно улучшается. Состав питательной среды, в принципе, тот же, что и при поверхностном культивировании клеток.

Клетки в суспензии имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками, выращиваемыми статистическим способом на агаризованной поверхности: клетки популяции находятся в однородных условиях питания, аэрации и удаления токсических метаболитов клеточного окружения: у них легче проследить влияние на рост и метаболизм различных экзогенных факторов: они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических исследований: на них реальнее возможность получения стабильной клеточной популяции.

3.1 Обычно для получения суспензионной культуры клеток используется каллусная ткань. Возможно получение суспензионной культуры из эксплантов, помещенных в жидкую среду (например, пыльников). Возникающие на поверхности экспланта каллусные клетки могут отрываться и переходить в среду, давая начало суспензии. Но это длительный и малоэффективный процесс. Для некоторых исследований культуру клеток получают путем ферментативной мацерации, например, из мезофилла листа, но такую суспензию невозможно поддерживать в течение длительного времени.

Основным способом получения суспензионных культур является культивирование рыхлого недифференцированного каллуса в жидкой среде на качалке. При этом каллус легко распадается на отдельные клетки и клеточные агрегаты. Рыхлый оводненный каллус выращивают специально для этих целей на среде с 2,4 –Д с уменьшенным содержанием или даже с исключением цитокининов. Хороший эффект на дезагрегацию каллуса оказывает также исключение из питательной среды Са2+, поскольку вследствие этого меньше образуется пектината кальция – основного связывающего материала растительных клеток. Пектинат кальция можно удалить воздействуя на каллус пектиназой.

Часть каллусной ткани в жидкой среде при ее перемешивании распадается на клетки и небольшие клеточные агрегаты, образуя первичную суспензию. Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, от больших клеточных агрегатов ее фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлон либо отбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждения крупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение нескольких минут. Кроме того, долю одиночных клеток и мелких агрегатов увеличивают частые пересевы легких фракций суспензии. На степень диссоциации клеток оказывает влияние также состав питательной среды, способы аэрации и перемешивания суспензии. Несмотря на все усилия, суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50-60 %, остальное приходится на долю групп из 2-10 клеток и многоклеточ-ные агрегаты. В очень крупных агрегатах наружные и внутренние слои клеток оказываются в неравноценных условиях питания и аэрации.

С целью получения высокодиспергированной суспензионной культуры чаще всего пытаются контролировать состав питательной среды. Имеются сведения, что ауксины оказывают положительное влияние на процессы диссоциации клеток, а цитокинины, напротив, тормозят их. Следовательно, условия, благоприятствующие растяжению клеток и тормозящие их деление, способствуют максимальной диссоциации суспензионных клеток.

Природа угдеводов в питательной среде, оказывая влияние на межклеточные контакты через изменение поверхностных полисахаридов, также может играть определенную роль. Так, введение в питательную среду галактозы, раффинозы или сахарозы приводило к формированию очень больших клеточных агрегатов в суспензии клеток розы. Выращивание клеток с добавлением целлюлолитических ферментов (пектиназа, целлюлаза) в сочетании с осмотиком увеличивало дисперсию суспензии.

Как бы ни заманчива была перспектива получения в суспензии популяции, состоящей исключительно из отдельных клеток, с точки зрения биологии растительной клетки такая задача представляется малореальной. Для этого необходимо, чтобы после образования срединной пластинки дочерние клетки расходились до начала их следующего деления. Хорошей считается суспензия, состоящая из морфологически выравненных клеток, имеющих небольшие размеры и агрегированных в мелкие группы, включающие не более 10 клеток. Оптимальная плотность клеток в суспензии, обеспечивающая хороший рост, составляет 105-106 на 1 мл среды.

Суспензионные культуры пересевают чаще, чем каллусные, из которых они были получены. Инокулюм - это часть суспензионной культуры, используемая для пересадки на свежую питательную среду. Инокулюм отбирают стерильными пипетками, шприцами или просто переливают определенную часть суспензии. Последний способ является единственно приемлемым для культур, содержащих крупные агрегаты клеток.

3.2 Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькими способами. Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование. Клетки растут в постоянном объеме питательной среды на установках качального или роллерного типа. Такая система закрыта для всего, кроме газов и летучих продуктов метаболизма. Оказывается при этом в колбах накапливается значительное количество углекислого газа. После замедления роста суспензия разводится до начальной плотности, и цикл выращивания повторяется. Цикл выращивания - это период от помещения инокулюма в свежую среду до следующего субкультивирования. Для накопительных культур чаще всего используются конические широкогорлые колбы разных размеров на платформенных качалках кругового или полукругового типа со скоростью вращения 60-120 оборотов в минуту. Клетки растений, несмотря на ряд специфических особенностей, подчиняются тем же законам роста, что и микроорганизмы, поэтому для их выращивания применяют технологию и аппаратуру, принятую в работе с микроорганизмами. Микроорганизмы


обычно культивируют в особых аппаратах, называемых ферментерами. Накопительные культуры можно выращивать в лабораторных ферментерах рабочим объемом 0,5-10 л. По сравнению с глубинным выращиванием в колбах на качалке при культивировании клеток в ферментерах появляются принципиально новые возможности, связанные с их конструкцией.

На культуру клеток в ферментерах можно в любой момент воздействовать различными факторами (температура, свет, газовый режим, физиологически активные вещества, рН и др.) и отбирать пробы клеток для определения динамики роста и метаболизма популяции в цикле выращивания. То есть, не нарушая режима асептики, можно контролировать рост и продуктивность биомассы, изучать влияние на эти процессы различных воздействий. Вместе с тем культивирование растительных клеток в ферментерах сопряжено с трудностями, вытекающими из специфических особенностей клеток высших растений. Наличие вакуоли и целлюлозно-пектиновой оболочки, придающей клеткам не только прочность, но и хрупкость, обуславливает их подверженность механическому стрессу при перемешивании и аэрации. Опасность механического стресса усиливается на стадии растяжения клеток.

Ферментеры различных конструкций обеспечивают перемешивание и аэрацию по-разному: вращаясь вокруг собственной оси, будучи в наклонном состоянии, перемешиванием магнитными и механическими мешалками, продуванием сжатого стерильного воздуха через суспензию. Конструкция лопастей мешалок бывает разной, и вращаются они с разной скоростью.

Высокая скорость перемешивания ведет к разрушению клеток, снижение интенсивности перемешивания может привести к оседанию части клеток к их гибели. Рост биомассы, которого так стараются добиться в работе ученые, ведет к возрастанию вязкости, что так осложняет культивирование. В отличие от микроорганизмов растительные клетки слипаются между собой и с поверхностями культиватора. Кроме того, они могут скапливаться в верхней части сосуда, образуя пену. Перечисленные особенности растительных клеток заставляют исследователей очень тщательно подходить к выбору типа культиваторов и режиму перемешивания в зависимости от целей и задач экспериментов с суспензионной культурой.

Способ, при котором клетки выращиваются в проточном режиме, называется непрерывным культивированием. В основу создания проточных систем легли опыты, в которых было обнаружено, что добавление в суспензию в фазу экспоненциального роста культуры порций свежей питательной среды позволяет долго поддерживать деление клеток. Непрерывное культивирование может осуществляться в закрытой проточной, полупроточной и открытой проточной системах.

В закрытой проточной системе суспензионная культура непрерывно снабжается свежей средой, приток которой сбалансирован оттоком равного количества использованной среды. В такой системе хорошо изучать влияние различных факторов на метаболизм клеток.

При полупроточном режиме выращивания определенная часть суспензии время от времени отбирается и оставшаяся часть разбавляется свежей средой.


Применяется для получения большой биомассы с целью ее биохимического исследования.

Открытая проточная система устроена так, что обеспечивает баланс между притоком свежей питательной среды и удалением равного объема клеточной суспензии. Скорость удаления части клеток из системы должна соответствовать скорости образования новых клеток в результате деления, это создает равновесное состояние между ростом клеток (постоянством скорости клеточного деления) и биосинтезом (постоянством состава и метаболической активности).

В открытой проточной системе исследуются взаимосвязи между процессами роста и метаболизма, те изменения, которые происходят при переходе клеток от одного состояния к другому, а также условия оптимального режима культивирования для получения максимального количества вторичных метаболитов. В основу непрерывного культивирования могут быть положены принципы хемостата и турбидостата, разработанные при культивировании микроорганизмов (рис. 2).

 

 

Рисунок 2 - Схемы биореакторов для проточного культивирования

микроорганизмов

А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической

плотности.
1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос,

5 – фотоэлемент, 6 – источник света

 

В хемостатном режиме непрерывное культивирование идет под воздействием лимитирующего рост фактора. Хемостатная культура представляет собой перемешиваемую суспензию, в которую с постоянной скоростью поддается свежая среда с заданной концентрацией какого-то лимитирующего рост компонента и с такой же скоростью отбирается часть культуры. Общий объем суспензии остается постоянным. При выращивании клеточных суспензий в хемостатном режиме скорость размножения клеток регулируется концентрацией лимитирующего фактора. Скорость роста и плотность клеточной популяции проходят в соответствии с заданной скоростью поступления среды (скорость разбавления), т.е. подачей лимитирующего фактора и других компонентов среды. Это приводит популяцию в стационарное состояние, для которого характерны выравненность физиологического состояния, постоянства концентрации лимитирующего фактора и других компонентов среды.

Принцип турбидостата предусматривает непрерывное культивирование без внешнего лимитирования, рост клеток популяции поддерживается на определенном уровне регулированием оптической плотности культуры. Для этого подходят суспензии с низкой плотностью клеток и высокой удельной скоростью роста, т.е. популяции в начальные фазы роста. Турбидостат представляет собой хемостат, дополненный фотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности культуры. Рост клеточной популяции поддерживается на заданном уровне автоматически с помощью фотометрической регуляции подачи среды.

Хемостатный и турбидостатный режимы применяют с целью стабилизации клеточной популяции в определенном состоянии роста и поддержания его неограниченное время. Эти приемы культивирования очень ценны для изучения регуляции роста и метаболизма клеток в строго стандартных условиях под влиянием различных лимитирующих и ингибирующих факторов. Однако, таких работ очень мало, что связано с новизной метода и техническими трудностями. Препятствием к культивированию клеток высших растений в проточном режиме является их высокая чувствительность к повреждениям, агрегированность, длительное время генерации.

 

Контрольные вопросы:

1. Какие условия необходимы для культивирования клеток?

2. Что регулирует образование и рост каллуса?

3. Что называется дифференциацией и дедифференциацией?

4. Способы получения суспензионной культуры.

5. Преимущества суспензионной культуры по сравнению с поверхностным культивированием клеток?

6. Способы культивирования клеток в жидкой среде.

7. Объясните понятия: каллус, тотипотентность, культура клеток, дифференциация, растение-регенерант, эксплант.

 

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Для культивирования клеток растений | Биология культивируемых клеток
Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-01-04; Просмотров: 2119; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.011 сек.