Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов

Техника посева микроорганизмов на питательные среды

Посев уколом осуществляется уколом микробиологической петлёй или иглойв столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур.

Посев петлей (посев штрихами) по методу Гольда. На внешней стороне дна чашки Петри с питательным агаром проводят разграничительные линии, разделяющие её на 4 сектора. Исследуемый материал вносят петлёй в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлёй, не изменяя её положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток микроорганизмы вырастают в виде отдельных колоний.

Посев шпателем по методу Дригальского. Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлёй или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нём микроорганизмы в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду свежескошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая материал из верхнего края роста культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно выделить чистую культуру.

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 37⁰С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-45⁰С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К₂СО₃ и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О₂ и выделением СО₂.

Газ-пак (Generbaganaer). Система Generbaganaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 37⁰С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-45⁰С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na₂CO_3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Выделение чистой культуры бактерий - аэробов из материала, содержащего смесь микробов, занимаеткак правило 3 дня и производится по следующей схеме:

1 день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного по Граму - для предварительного ознакомления с микрофлорой данной смеси. Посев материала петлёй на чашку Петри с питательной средой штриховым методом для получения изолированных колоний. Засеянные чашки помещают в термостат на сутки.

2 день - изучение колоний, выросших на чашках, отбор изолированных колоний, описание их и микроскопия мазков из изолированных колоний (окраска по Граму) для проверки однородности микробов в колонии. Пересев изолированной колонии на скошенный агар для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат на сутки.

3 день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре, путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Контрольные вопросы.

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липоидов, углеводов, минеральных веществ. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм (катаболизм ианаболизм)? Особенности обмена веществ бактерий. Механизм расщепления бактериями питательных веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Какие типы питания имеются у патогенных микробов? Питательные среды - для чего применяются, каким требованиям они должны соответствовать? Классификация питательных сред по составу, по консистенции, по назначению. Обычные (простые) питательные среды. Специальные питательные среды, для чего применяются, принцип их действия. Дифференциально-диагностические среды, принципы их действия, для чего применяются, примеры. Что такое рост микроба? Что такое размножение микроба? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры. Размножение бактерий в непрерывно-проточной среде. Культивирование бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм, клон?Что такое колония микробов? Методы выделения чистой культуры бактерий. Рассказать поэтапно (по дням) выделение чистой культуры бактерий аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры анаэробов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

1. Напишите в тетради классификацию питательных сред (приведите примеры):

1. По происхождению

2. По консистенции

3. По назначению:

2. Составьте и начертите схему выделения чистой культуры бактерий по дням и укажите цель своих действий на каждом этапе.

Работа студента на практическом занятии.

1. Питательные среды. Посмотрите набор питательных сред, классифицируйте их по происхождению, консистенции, составу. Особое внимание обратите на назначение питательных сред.

2. Выделение чистой культуры бактерий (1 день). Возьмите пробирку со смесью микробов, осмотрите её. Приготовьте мазок. При работе с жидким материалом самое главное - не пролить! Держите пробирку всегда отверстием вверх. Взяв из пробирки, каплю материала, сначала закройте её пробкой, поставьте в штатив и только после этого наносите взятый петлёй материал на предметное стекло. Мазок окрасьте по Граму в модификации Синёва, промикроскопируйте, зарисуйте. Затем посейте исследуемый материал на чашку смясо-пептонным агаром (МПА). Укажите на чашке номер рабочего места и группы. Положите чашку кверху дном в ящик на подготовительном столе.

Дата добавления: 2014-01-04