У бактерий

Мутационной природы изменения наследственных признаков

Изменчивость микроорганизмов, доказательства

Генетика – наука о наследственности и изменчивости живых организмов. В отличие от классической генетики, генетика бактерий – относительно молодая отрасль микробиологии, первые работы по которой появились в начале 1940-х годов. Генетика бактерий пользуется всеми терминами и определениями, разработанными для классической генетики. С момента возникновения и до настоящего времени она завоевала необычайную популярность. Успех популярности генетики бактерий обусловлен двумя главными причинами:

Во-первых, основные принципы генетики бактерий в равной степени применимы ко всем животным и растительным организмам независимо от того, являются они многоклеточными или одноклеточными. Это связано с тем, что все живые организмы обладают наследственным материалом, заключенным в нуклеиновые кислоты.

Во-вторых, в исследованиях по изучению природы наследственности прокариоты в значительной степени заменили такие излюбленные объекты генетики, как дрозофила, мышь, кукуруза, поскольку бактерии имеют высокую скорость размножения и образуют популяции с высокой плотностью, а процесс их культивирования относительно прост. Это позволяет проводить генетический анализ в короткие сроки с использованием огромного числа особей, которые не занимают значительных площадей. Кроме того, использование клеток бактерий позволяет изучать биологические явления на уровне одной клетки, избегая их сложных взаимодействий и взаимозависимостей, типичных для высших организмов.

Термин «мутация» введен Г. де Фризом (1901), изучавшим изменчивость и наследственность у растений и определившим мутацию как «скачкообразное изменение наследственного признака». Это понятие М. Бейеринк (1912) позднее распространил и на бактерии. Мутация – событие редкое и обычно спонтанно происходит с частотой 1·10^–4–1·10^–10.

В результате постановки ряда экспериментов были получены данные, свидетельствующие о том, что у бактерий мутации носят спонтанный и ненаправленный характер. К их числу относятся, прежде всего, эксперименты С. Лурия, М. Дельбрюка, Г. Ньюкомба и супругов Е. и Дж. Ледерберг.

В 1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюк доказали спонтанное возникновение мутантов бактерий с помощью флуктуационного теста. В эксперименте с участием бактериофага Т1, обладающего высокой вирулентностью в отношении бактерий E. coli, исследовался процесс возникновения устойчивости у данных бактерий к фагу.

При постановке эксперимента культуру бактерий E. coli, полученную из одной клетки (т. е. чистую культуру), чувствительную к бактериофагу Т1, выращивали до определенной плотности и разделяли на две части. Далее одну из них распределяли по 1 мл в 100 пробирок. Вторую часть оставляли в объеме 100 мл. После этого все культуры инкубировали в одинаковых условиях. На следующем этапе выращенные культуры засевали на агаризованную среду с фагом Т1. В результате на поверхности среды формировалось определенное количество колоний, которые можно рассматривать как устойчивые к фагу. Устойчивые к фагу Т1 бактерии сохраняют данное свойство также и при последующем их культивировании в отсутствии фага (рис. 1).

Принцип флуктуационного теста заключается в следующем: если устойчивые мутанты возникают при контакте с фагом (изменчивость адаптивная), то каждая культура независимо от того, из какой части она была взята, должна содержать приблизительно одинаковое количество устойчивых клеток. Если же устойчивые бактерии возникли спонтанно, до обработки фагом, то следствием этого является тот факт, что их количество в засеянных независимых культурах (100 пробирок) будет отличаться от количества, полученного при анализе образцов, из одной и той же (100 мл) культуры.

Независимо полученные результаты свидетельствуют о том, что культуры разного происхождения действительно обнаруживают более резкие колебания (флуктуации) в содержании устойчивых клеток (0, 103, 62, 3, 159 и т. п.), чем пробы, взятые из одного и того же образца (142, 140, 155, 146, 110 и т. п.), что подтверждает гипотезу о спонтанном характере возникновения мутаций.

В 1949 г. Г. Ньюкомб поставил другой по методическому подходу эксперимент с фагом Т1 и бактериями E. coli, который впоследствии получил название перераспределительного теста. Он засевал чашки Петри культурой E. coli, чувствительной к фагу Т1, с образованием сплошного газона. Засеянные чашки инкубировались при оптимальных условиях (37 ºС) в течение 5 ч. За это время каждая из высеянных клеток формировала микроколониию. Затем в половину засеянных чашек Петри вносили по 0,1 мл физиологического раствора и с помощью шпателя перераспределяли клетки на поверхности среды. Остальные чашки оставались нетронутыми (контроль). На поверхность всех чашек с помощью пульверизатора Ньюкомб наносил суспензию фага Т1, и чашки повторно помещал в термостат. После инкубирования определяли число колоний, являющихся потомством устойчивых клеток.

Принцип, положенный в основу данного теста, предполагает, что устойчивые клетки возникают вследствие спонтанных мутаций до контакта с фагом, и на чашках, где бактерии были перераспределены, должно формироваться больше устойчивых колоний, чем на контрольных чашках, так как каждая клетка из микроколонии устойчивых бактерий после перераспределения сформирует колонию, устойчивую к фагу Т1 (рис. 2).

Рис. 1. Флуктуационный тест С. Лурия и М. Дельбрюка

Именно эти результаты и были получены Г. Ньюкомбом, которые прямо свидетельствуют о том, что фагоустойчивые мутанты возникают до контакта с фагом в результате спонтанных мутаций. Бактериофаг в этом случае выступает лишь в качестве селективного агента, позволяющего выявить небольшое количество фагоустойчивых мутантов, присутствующих в популяции.

Таким образом, результаты флуктуационного и перераспределительного тестов доказывают, что мутации у микроорганизмов возникают ненаправленно до воздействия селектирующего агента (в данном случае фага Т1).

Рис. 2. Перераспределительный тест Ньюкомба

В 1952 г. супруги Е. и Дж. Ледерберг предложили способ непрямого отбора мутантов методом реплик, или отпечатков, и использовали его для доказательства спонтанной природы возникновения мутаций у бактерий. Супруги Ледерберг провели следующий эксперимент. Чистую культуру фагочувствительных бактерий E. coli выращивали в бульоне до концентрации 1·10⁸ кл/мл, после чего ее высевали на поверхность питательной среды в чашке Петри для образования газона сплошного роста. Затем при помощи метода реплик производили пересев бактерий параллельно на две чашки – одну с обычной средой (1); другую – предварительно засеянную фагом (2). Чашки помещали в термостат для инкубирования. На чашке, засеянной фагом, сформировались отдельные колонии фагоустойчивых бактерий. На чашке без фага наблюдался сплошной рост. Чашки 1 и 2 совмещали, и из чашки с обычным питательным агаром (1) производили пересев в бульон участка, соответствующего ареалу фагоустойчивых колоний в чашке с фагом (2). Размножившиеся клетки рассевали на свежей питательной среде в чашках и после инкубации переносили с помощью стерильного бархатного штампа в две чашки (с обычной средой и со средой, засеянной фагом) (рис. 3).

Такую процедуру повторяли многократно, и в итоге была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом. Этот эксперимент явился еще одним доказательством мутационной природы изменчивости у бактерий.

Мутационная изменчивость относится к генотипической, или наследственной, изменчивости, так как при этом возникающие изменения в молекуле ДНК бактерий передаются по наследству.

Рис. 3. Непрямой отбор фагоустойчивых мутантов методом реплик

(предложен в 1952 г. супругами Е. и Дж. Ледерберг)

Метод реплик (в микробиологии) заключается в том, что с исходной чашки Петри, где на твердой среде растут колонии бактерий, делается отпечаток на ворсистую ткань, а затем с ткани бактерии переносятся на несколько других чашек, где рисунок их расположения оказывается тем же, что на исходной чашке. Размножившиеся клетки рассевали на свежей питательной среде в чашках и после инкубации переносили с помощью стерильного бархатного штампа в две чашки (с обычной средой и со средой, засеянной фагом) (рис. 3). Такую процедуру повторяли многократно, и в итоге была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом. Этот эксперимент явился еще одним доказательством мутационной природы изменчивости у бактерий.

Рис. 3 -Непрямой отбор фагоустойчивых мутантов методом реплик

(предложен в 1952 г. супругами Е. и Дж. Ледерберг)

Дата добавления: 2013-12-13