Микроскопический метод исследования. Простые и сложные способы окраски

Занятие 3

Рецепты красителей

Окраска препарата

Красители, используемые в микробиологической практике, представлены амфорными или кристаллическими порошками. По цвету бывают: красные (фуксин, нейтральный красный), синие (метиленовый синий), фиолетовые (генцианфиолет, кристаллфиолет), желто-коричневые (везувин, христоидин), зеленые (малахитовый, бриллиантовый). Из этих красителей первоначально готовят спиртовые растворы по прописи 1:10 (1 часть красителя, 10 частей этилового спирта). Смесь помещают на 24 часа в термостат при 37ºС. Затем фильтруют. Спиртовые растворы красителей хранят в склянках из темного стекла длительный срок. Из них готовят рабочие растворы красителей. Сейчас централизовано готовят наборы красок для окраски по Граму, Цилю-Нильсену, Ожешко, Бурри-Гинсу.

Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микробов, спор и капсул):

насыщенного спиртового раствора фуксина — 10 мл.

5% раствора карболовой кислоты — 9 мл.

Фуксин Пфейффера (для окраски микробов по Грамму и для простого метода окраски)

фуксин Циля — 1 мл.

дистиллированной воды — 9 мл.

Отношение микробов к красителям называется тинкториальными свойствами.

Знать:

1. Сущность микроскопического метода исследования;

2. Виды микроскопирования, их характеристики;

3. Устройство микроскопа «Биолам»;

4. Правила работы и ухода за микроскопом;

5. Простые способы окраски, их значение;

6. Сложные способы окраски, их значения;

7. Окраска по Граму.

Уметь:

1. Приготовить препарат микробной культуры, окрасить простым и сложным способом;

2. Провести иммерсионную микроскопию; зарисовать.

Микроскопический метод исследования применяют для изучения окрашенных и не окрашенных препаратов. Он позволяет изучить тинкториальные свойства, отношение к окраске, морфологию клеток: внешний вид клетки, наличие спор, капсул, жгутиков; подвижность и взаиморасположение клеток: попарно, цепочкой, хаотично и т. д.

Виды микроскопии:

1. Световая (изучает микроорганизмы размером не более 0,2 мкм)

2. Электронная (изучает микроорганизмы размером менее 0,2 мкм)

Виды световой микроскопии:

1. Иммерсионная микроскопия — применяется для изучения окрашенных препаратов с объективом 90 и выше.

2. Фазово-контрастная — применяется для изучения неокрашенных препаратов. Глаз человека способен различать длину световой волны (цвет, интенсивность, яркость), но не может обнаружить различия в фазе преломления. При изучении неокрашенных микробов, которые отличаются от окружающей среды только по показателю преломления, на рассматриваемом фоне при обычной микроскопии их не увидеть. Поэтому для изучения микроорганизмов в неокрашенном виде, используют фазово-контрастную микроскопию. Для этого есть фазово-контрастные устройства, которые можно установить на любой микроскоп. Устройство состоит из специального объектива и конденсора с поворачивающим диском. Настройка заключается в следующем: заменить обычный объектив на фазово-контрастный, заменить конденсор. Видим: на темном фоне микроорганизмы светлые — негативный препарат, или на светлом фоне — микроорганизмы темные — позитивный препарат. Но не все микроорганизмы можно изучить при данной микроскопии; например, лептоспиры, вирус изучают при темнопольной микроскопии.

3. Темнопольная микроскопия. Она основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для данной микроскопии используют обычные объективы, но специальные темнопольные конденсоры, у которых центральная затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не поступают. Объект освещается косыми боковыми лучами, и в объектив попадают лучи, рассеянные частицам, находящимися в препарате. Видим: якро-светящиеся микроорганизмы на темном поле. Настройка: установить свет; заменить светлопольный конденсор на темнопольный; на верхнюю линзу конденсатора нанести иммерсионное масло и поднять конденсор до соприкосновения нижней поверхностью предметного стекла; объектив 8 фокусируют на препарат; с помощью центровочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно; поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения яркого пятна — должно быть равномерное освещение; затем устанавливают объектив 40 и исследуют объект.

4. Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светится при освещении их УФЛ или синим светом. При освещении синим светом свечение от зеленого до красного цвета. Под влиянием УФЛ свечение любого цвета. Алгоритм люминесцентной микроскопии: приготовить мазок, высушить, зафиксировать; окрасить растворами люминесцирующих красителей — хлюорохромами, которые избирательно взаимодействуют с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что используются в очень малых концентрациях и ии могут быть окрашены фиксированные и живые клетки. Вариант данной микроскопии — РИФ — реакция иммуно-флюоресценции — используется для экспресс-диагностики.

Дата добавления: 2013-12-13