Определение ферментов, участвующих в процессе дыхания у бактерий с различным типом дыхания (окислительные формы)

Определение протеолитической активности микробов

Для определения данной активности исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок.

Посев на желатин. К МПБ добавляют мелко нарезанный желатин на 100 мл 10-15гр. Она набухает и растворяется при медленном нагревании. Добавляют 10% раствор питьевой соды до PH = 7, фильтруют. Разливают в пробирки столбиком. Стерилизуют текучим паром. При наличии желатиназы происходит расщепление белков желатины в форме: «чулка» - стафилококк, «воронки» - холерный вибрион, «перевернутой елочки» - возбудитель сибирской язвы. Наблюдение за посевом ведется до 20 суток.

Определение индола по Мореллю. Индол образуется при расщеплении триптофана. На исследуемую культуру засевают в б/м Хоттингера, где содержится триптофан. Сразу после посева под пробку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Посевы инкубируют при 37С 24-48 часов. Образование индола в бульоне сопровождается окрашиванием нижнего конца индикаторной бумаги в слабо розовый цвет.

Определение индола с помощью реактива Ковача. В пробирку наливают 5 мл исследуемой культуры. Вносят 1 мл ксинола или эфира, встряхивают. После отстаивания осторожно добавляют раствор Ковача так, чтобы он образовал слой между ксинолом и средой. При положительной реакции появляется красное кольцо. Реакция высоко чувствительная.

Проба на H₂S. Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую сульфат железа. При появлении H₂S среда чернеет за счет образования сернистого железа. Образование H₂S связано с расщеплением серосодержащих аминокислот, чаще цистеина. Определить H₂S можно с помощью индикаторной бумажки, пропитанной ацетатом свинца — бумажка чернеет.

Определение каталазы. Данной активностью обладают анаэробы факультативные и аэробы. Каталаза расщепляет H₂O₂ на атомарный кислород и воду. В пробирку наливают 1-2 мл испытуемой бульонной культуры, добавляют несколько капель 3% H₂O₂ в присутствии каталазы выделяются пузырьки газа.

Реакция на цитохромоксидазу. Данный фермент имеется у бактерий с аэробным типом дыхания. К культуре добавляют по несколько капель 1% спиртового раствора L-нафтола и 1% водного раствора метола. Положительная реакция проявляется в появлении лиловой окраски.

Определение пути утилизации глюкозы на ОФС. Среда позволяет дифференцировать окислительный путь утилизации глюкозы от ферментативного. Среда содержит набор солей, пептидов, индикатор бромтимол синий, агар. Культуру засевают уколом в 2 пробирки с ОФС, разлитой столбиком. В одну пробирку поверх агара наливают вазелиновое масло. Посевы термостатируют 3-4 суток. При образовании из глюкозы кислоты происходит изменение цвета индикатора (из зеленого в желтый). Образование кислоты в пробирке без масла указывает на окислительную утилизацию глюкозы. Образование кислоты в обеих пробирках говорит от преобладании бродильных процессов. Отсутствие изменения цвета среды в двух пробирках свидетельствует об отсутствии утилизации глюкозы вообще.

Дата добавления: 2013-12-13